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巴氏染色的液基细胞学片子时间久了有褪色,想重新复染,但总达不到最佳的效果,主要问题表现在核的细微结构表达不如以前清晰,比如图片为胸水的液基制片褪色后复染,很纠结那些红不红蓝不蓝的核。
求高手指点步骤中那个环节需要改进,或者提供方案。先谢谢大家了!
我用的脱色步骤是:
----------------脱色------------------
1.旧片子泡二甲苯,直到去掉盖玻片和胶。
2.片子再泡新的二甲苯,3天。
3.过三缸无水乙醇,每缸一天。
4.1%盐酸酒精缸泡30min,脱核色。(1%盐酸酒精=99ml无水乙醇+1ml浓盐酸)
5.放入流水盒子里泡20min,脱浆色。
6.放入无水乙醇待用。
7.片子放在染色板上,不扣制片仓,不能让片子全干要保持水分。(每次2-4张操作)
------------------重染------------------
8.缓冲液(加到细胞圈内)2次 —— 苏木素1次,5s ——缓冲液2次,冲干净 —— 无水乙醇3次,冲干净 ——伊红1次,80s ——无水乙醇冲干净——放入无水乙醇缸,1min——二甲苯,5min以上——封片
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褪色彻底是做巴士重染的前提条件。
细胞核的染色原理是:细胞核内的染色物质主要是脱氧核糖核酸(DNA),DNA的双螺旋结构中,两条链上的磷酸基向外,带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以,细胞核被染成蓝色。
细胞浆内主要成分是蛋白质,为两性化合物,当pH值在3.6~4.7之间,即低于等电点时,胞浆中的蛋白质氨基端带正电荷,而EA50染液(由伊红、亮绿、等染料配成)是酸性染料,带负电荷,与氨基端合而使细胞浆染成从而是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或红色。
高锰酸钾为强氧化剂,褪色时先用高锰酸钾,可使留在细胞上的金属根(即苏木精染液中的媒染剂)与细胞分离,并阻止苏木精染料色素根与媒染剂中的铝化物形成蓝紫色色素沉淀。草酸具有漂白作用,而且酸能破坏苏木精和伊红的醌型结构,使色素与组织解离,从而达到脱色漂白作用。另外草酸是一种弱酸,与高锰酸钾溶液先后处理后的组织切片处于偏中性环境,有利于着色。常用的褪色剂盐酸乙醇液,对苏木精伊红褪色效果欠佳,细胞着色难以完全脱净。
褪色步骤:
将玻片放人二甲苯(两缸新二甲苯,主要目的是为脱胶彻底)内各30min;先后置人无水酒精、95%
酒精、70%酒精各5min,蒸馏水洗3min。褪色将水化的玻片浸入0.25%高锰酸钾中5min,蒸馏水洗3min;再置人0.5% 草酸漂白2 min,蒸馏水洗3min。
重染步骤和您的步骤一样,您再试一下。