各位老师：

           学生最近做IHC 可重复好多次都染不上色

             说说我的过程吧 ：烤片2小时 二甲苯 15分钟 各两次脱蜡 100% 95% 85% 75%梯度酒精 水化。蒸馏水冲洗2次；PBS洗3次/5min;高温高压修复10分钟；PBS洗5次/5min;3%H2O2封闭15分钟；PBS洗5次/5min;一抗4度过夜；取出孵育的一抗 ，室温30分钟；PBS洗5次/5min;滴加二抗增强剂A（北京中杉二抗试剂盒）37度水浴30分钟；PBS洗5次/5min；滴加二抗B，氺浴30分钟；PBS洗5次/5min;滴加DAB，镜下观察；蒸馏水冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，自来水返蓝；梯度酒精 二甲苯透明，中性树胶封片。

 结果：组织没一点染色 就是组织原色 重复好多次 但还是这样的结果 同样的标本 别人做不同指标就能做出来啊 只是抗体不一样而已！！

名称：图1
描述：图1

               您说的极是！这是脊髓的一个标本 我要染后角的神经元细胞！如你所说 那么我是不是可以这样认为呢？

                      1。您说显色弱 那我二抗37度 而且时间长些 会与一抗结合的更紧密 更易显色

                      2。您说没必要修复10分钟 喷气2分钟即可 那是不是我的修复时间太久也可能致抗原被破坏了？按理修复久些 抗原暴漏应该更充分 只是背景可能会深些。

                       3。一抗是刚买不久santa的 仔细核对过 可以做石蜡包埋免疫组化 

 这张图片是我做了近10次里唯一次染上色的。其余都是DAB镜下染色时都没变化 背景都出不来 一直保持组织原色 可等透明完后 却弱弱的有那么点表达 这个问题困扰我很久了 不知道问题何在？同样标本 做不同指标我的 同门就能做出来。

      另外 就这张片子染色情况还需要哪些改进   还望yang老师给学生指点，谢谢。

                      2。您说没必要修复10分钟 喷气2分钟即可 那是不是我的修复时间太久也可能致抗原被破坏了？按理修复久些 抗原暴漏应该更充分 只是背景可能会深些------我没有做过过度加热是否会造成抗原破坏的。

                       3。一抗是刚买不久santa的 仔细核对过 可以做石蜡包埋免疫组化 

 这张图片是我做了近10次里唯一次染上色的。其余都是DAB镜下染色时都没变化 背景都出不来 一直保持组织原色 可等透明完后 却弱弱的有那么点表达 这个问题困扰我很久了 不知道问题何在？同样标本 做不同指标我的 同门就能做出来。-----为何不提高一抗浓度试试呢？

      没有具体的抗体名称等我们只能瞎猜！无法切实的帮助你。

 感谢yang老师在百忙中解答学生的问题！

      有个关键细节忘告你了，我高温高压修复 是将修复液装在那种小铁钢子里 再在高压锅里放一定自来水 先预热修复液 再将片子放进修复液进行高温高压修复的 所以采用了那么久的 修复时间。 做的是p-jnk这个蛋白，santa cruz买的。