各位老师：

           学生最近做IHC 可重复好多次都染不上色

             说说我的过程吧 ：烤片2小时 二甲苯 15分钟 各两次脱蜡 100% 95% 85% 75%梯度酒精 水化。蒸馏水冲洗2次；PBS洗3次/5min;高温高压修复10分钟；PBS洗5次/5min;3%H2O2封闭15分钟；PBS洗5次/5min;一抗4度过夜；取出孵育的一抗 ，室温30分钟；PBS洗5次/5min;滴加二抗增强剂A（北京中杉二抗试剂盒）37度水浴30分钟；PBS洗5次/5min；滴加二抗B，氺浴30分钟；PBS洗5次/5min;滴加DAB，镜下观察；蒸馏水冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化，自来水返蓝；梯度酒精 二甲苯透明，中性树胶封片。

 结果：组织没一点染色 就是组织原色 重复好多次 但还是这样的结果 同样的标本 别人做不同指标就能做出来啊 只是抗体不一样而已！！

名称：图1
描述：图1

 感谢yang老师在百忙中解答学生的问题！

      有个关键细节忘告你了，我高温高压修复 是将修复液装在那种小铁钢子里 再在高压锅里放一定自来水 先预热修复液 再将片子放进修复液进行高温高压修复的 所以采用了那么久的 修复时间。 做的是p-jnk这个蛋白，santa cruz买的。

               您说的极是！这是脊髓的一个标本 我要染后角的神经元细胞！如你所说 那么我是不是可以这样认为呢？

                      1。您说显色弱 那我二抗37度 而且时间长些 会与一抗结合的更紧密 更易显色

                      2。您说没必要修复10分钟 喷气2分钟即可 那是不是我的修复时间太久也可能致抗原被破坏了？按理修复久些 抗原暴漏应该更充分 只是背景可能会深些。

                       3。一抗是刚买不久santa的 仔细核对过 可以做石蜡包埋免疫组化 

 这张图片是我做了近10次里唯一次染上色的。其余都是DAB镜下染色时都没变化 背景都出不来 一直保持组织原色 可等透明完后 却弱弱的有那么点表达 这个问题困扰我很久了 不知道问题何在？同样标本 做不同指标我的 同门就能做出来。

      另外 就这张片子染色情况还需要哪些改进   还望yang老师给学生指点，谢谢。