不会意思，对于酶标抗体的连接方式，我不是很明白）。| 图片： | |
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- 求助：一抗为IgM，整张片子都是很强的背景着色！怎样解决？
做免疫组化过程中遇到了难题，尝试了许多方法都无法解决，恳请大家的帮助。
我要检测的抗原是OA软骨中的X型胶原，一抗是abcam公司的产品，货号：ab49945，小鼠抗人单克隆抗体，类型为IgM，二抗购自JacksonImmunoResearch公司，兔抗鼠IgM（Peroxidase-conjugated Affinipure Rabbit Anti-Mouse IgM,μChain Specific (mimimal cross-reaction to Human Serum Proteins)）。步骤：免疫组化常规烤片，脱蜡，入水后，3%的过氧化氢室温阻断10min，胃蛋白酶37℃消化半个小时，然后用兔血清封闭30min，倾去血清后，加一抗，4℃过夜；加二抗，室温孵育一个小时，最后DAB显色，结果整张切片都是很深的背景着色，将一抗稀释到1:2000，二抗稀释到1:400，仍然是整张切片都是较深的背景着色。 一起做的还有II型胶原，一抗的类型是IgG，也是购自abcam公司，二抗也是Jackson公司的，步骤也相同，就染的很好，没有出现上面的问题。
请问，是不是因为一抗是IgM的原因，所以出现这么强的背景着色，那么有没有什么解决方法呢？跪求各位高手指点！
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×参考诊断
lzyr：很是抱歉，我在上次回答中，有一个建议考虑不周现收回（2.如果使用兔抗鼠IgM的二抗，不要用兔血清来封闭。）这个对你实验结果背景染色减少应该没有帮助，也就是说你可以使用兔血清封闭。
问题二：但我在网上看到的观点却是，如果一抗是IgM，那么二抗也必须要是IgM.这是个误区，二抗是特异的同特定种属的一抗结合，二抗同一抗的结合是二抗的可变区同一抗的y结构结合（IgG是单体y结构，而IgM为五倍体的y结构），也就是说二抗只管是否有某一种属来源的免疫球蛋白y结构而不用管对方是单倍体还是五倍体，所以二抗不是必须使用IgM类型（但可以使用）。现在病理科中用的CD15（霍奇金淋巴瘤的一种标记物）就是IgM型抗体，用平常的抗鼠IgG二抗链接的很好呀！因为平常大家绝大多数都是使用抗鼠IgG的二抗（>99.99%），反而对IgM类型的二抗掌握甚少。
你其他鼠抗实验结果良好说明该实验使用的jackson公司的二抗质量良好，你可以用这个二抗来进行IgM抗体的实验。
还有你是否做过同型阴性对照？这样将对你的实验优化很有帮助。
