楼主 发表于 2010-10-02 22:06|举报|关注(0)

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    做免疫组化过程中遇到了难题，尝试了许多方法都无法解决，恳请大家的帮助。

    我要检测的抗原是OA软骨中的X型胶原，一抗是abcam公司的产品，货号：ab49945，小鼠抗人单克隆抗体，类型为IgM，二抗购自JacksonImmunoResearch公司，兔抗鼠IgM（Peroxidase-conjugated Affinipure Rabbit Anti-Mouse IgM,μChain Specific (mimimal cross-reaction to Human Serum Proteins)）。步骤：免疫组化常规烤片，脱蜡，入水后，3%的过氧化氢室温阻断10min，胃蛋白酶37℃消化半个小时，然后用兔血清封闭30min，倾去血清后，加一抗，4℃过夜；加二抗，室温孵育一个小时，最后DAB显色，结果整张切片都是很深的背景着色，将一抗稀释到1:2000，二抗稀释到1:400，仍然是整张切片都是较深的背景着色。

    一起做的还有II型胶原，一抗的类型是IgG，也是购自abcam公司，二抗也是Jackson公司的，步骤也相同，就染的很好，没有出现上面的问题。

    请问，是不是因为一抗是IgM的原因，所以出现这么强的背景着色，那么有没有什么解决方法呢？跪求各位高手指点！

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1 楼    发表于2010-10-06 19:01:00举报|引用

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    版主的意思是一抗的浓度可以再继续稀释？那一般你们都是稀释多少倍？

    关于修复条件，我是用胃蛋白酶修复，如果用双修复的话对减少非特异性染色有帮助吗？

    二抗同HRP的连接，不是Biotin+Avidin的方式，也不是那种Evision的放大方式，而是通过共价键直接连接的。（不会意思，对于酶标抗体的连接方式，我不是很明白）。

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2 楼    发表于2010-10-05 15:44:00举报|引用

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 附：我买的胃蛋白酶是Sigma公司的，货号P6887,3200-4500units/mg protein,

配制：

 0.1N的HCl 100ml + 400mg的的胃蛋白酶粉末

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3 楼    发表于2010-10-05 14:49:00举报|引用

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    一抗浓度我已经稀释到1：2000了，从1:2000到1:2000的我都试过了，但背景着色仍然存在。只是稍微淡一些。我用的二抗是那种最普通的，就是一个二抗分子链接一个HRP，非检测放大系统。

    另外“海上明月”提供的三条建议，后两条而都是严格遵守的，第一条胃蛋白酶处理时间，我一直都是消化30min，是不是还要再缩短？谢谢！

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4 楼    发表于2010-10-04 21:14:00举报|引用

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     再次感谢版主详细的讲解。版主推荐的两种方法我都试过了，一是用羊抗鼠IgG来做，另外不加兔血清的我也做了，可结果仍然是整张片子都是背景着色。

    （本想拍两张片子给版主看下，但现在正好放假，拍照的显微镜无法使用，所以只能等两天了。）

    还有，版主提到的同型阴性对照是指使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量以及相同的免疫Ig及亚型的免疫球蛋白来代替一抗吗，即对于我的实验来讲，就是小鼠的IgM？

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5 楼    发表于2010-10-03 11:09:00举报|引用

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 多谢版主的指点，但我在网上看到的观点却是，如果一抗是IgM，那么二抗也必须要是IgM。还有，如果用版主推荐的第二种方法的话，是不是就不需要封闭这一步了？再次恳请版主赐教！

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