1、乙醇－福尔马林（A－F液）固定试剂与复合固定试剂理化分析

A－F液是10％的中性福尔马林和80～95％浓度的乙醇而制成。优点是对组织渗透性强，固定均匀，对组织收缩较小。也是免疫组织化学染色中适应性较广泛的固定液^【3】缺点是对脂肪及类脂固定和脱脂不是很强，易使组织中抗原蛋白被封闭，产生蛋白质交联反应，致免疫组织化学染片方法不能清晰地显示抗原定位，需经高温、高压、酶等修复抗原。

已证实新鲜组织经过72小时福尔马林固定的组织中抗原发生不同程度的不可逆地丢失，对固定一周以后组织抗原丢失更严重，其抗原几乎不能被检出^【4】。福尔马林固定的组织时间越长，抗原丢失越重，抗原越少对免疫组化准确性影响越大。

格林公司生产的复合性固定试剂是参考A－F液和Bouin液^【5】，不用饱和苦味酸水溶液。以95％乙醇和6％浓度的中性福尔马林（其实际甲醛浓度为2.3％）溶剂为主，和少量乙酸、丙酮等溶剂为辅，增加了软化、脱脂、强渗透性有机化学试剂。在组织固定的同时，兼有脱水、脱脂的兼容性。并有防止福尔马林聚合出现白色沉淀而影响蛋白质固定的少量解聚溶剂和微量碱性化学物质，使PH值在6.5～7微偏酸性，或接近中性。在酸的环境液体内多聚甲醛可以解聚而还原出甲醛^【6】。乙酸等羧酸类有机溶剂能沉淀核蛋白，可停止细菌和酶的活动而避免组织自溶现象，能固定脂肪及类脂，有很好的脱脂性。脂肪细胞膜不会皱缩，对组织渗透力强，对染色体保存好，对细胞核染色质着色力强，使核显示清晰。缺点是使组织膨胀。加入少量比例的丙酮和碱性化学物质，则消除了羧酸类使组织膨胀的缺点，又能使较硬的皮肤等组织角层较厚的组织有软化作用^【5】见图9。也消除了丙酮本身可使组织收缩剧烈的缺点；同时又保留了丙酮对组织固定渗透快和与乙醇能增加AgNOR（核仁组成区的嗜银蛋白）反映的敏感性^【5】。又弥补了95％乙醇不利于染色体的的固定。复合固定试剂以95％乙醇为主，能沉淀白蛋白、球蛋白、核蛋白，又易与水混溶，其脱水能力强，有硬化组织的理化特性，可弥补羧酸类有机溶剂不能沉淀白蛋白、球蛋白及使组织膨胀的缺点。

因此复合性固定试剂有强渗透力，能迅速地渗入组织内部，能使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率造成光学上的差异，见图5，以便染色后易于鉴别和观察，并兼有硬化作用，使组织硬化适度，利于制片，不会使组织过度收缩或膨胀而失去原有形态结构。

复合固定试剂含6％浓度的中性福尔马林，能否减轻抗原蛋白被封闭，产生蛋白质交联的反应？经多种免疫组化染色证明低浓度福尔马林能做到。当然不用福尔马林也就不存在这一问题。减少福尔马林使用量也应认为在随后长期储存的蜡块中的抗原丢失减少或不用福尔马林其组织抗原也不存在丢失。

醛和酮以及羧酸类溶剂的结构是分子中都含有羰基，羧基由羰基和羟基组成的，能够产生相互间协同反应，复合固定试剂中福尔马林含量减少，则由羧酸类、酮类等溶剂弥补，其固定效果只能加强而不会降低。复合固定试剂PH值在6.5～7，微偏酸，对显示DNA、RNA的效果很好。