【摘要】 目的  探讨体液内查找癌细胞的新方法，利用免疫组织化学染色方法对体液中细胞进行类型鉴别，提高体液内癌细胞病理诊断的准确性和检出率，进行耐药基因表达产物的检测，提高恶性胸腹水的治疗效果。 方法  目前体液内查找癌细胞，一般使800型离心沉淀器离心沉淀涂片，或者使用涂片离心机，或者使用琼脂包埋细胞块石蜡切片。使用涂片离心机简单快捷，但设备较贵，不能用于免疫组织化学染色检查，有时遇到疑难涂片，很难对肿瘤类型进行分类，有时难以区分是退变的肿瘤细胞还是增生退变的间皮细胞，这就需要细胞块石蜡切片进行免疫组织化学染色。使用琼脂细胞块石蜡包埋切片程序较多，需要事先制作琼脂较为麻烦。体液直接离心沉淀制作细胞块石蜡切片制作程序简便，结果稳定:直接离心沉淀、固定、脱水、浸蜡、包埋、HE和免疫组织化学染色。 结果  50例胸腹水采用普通离心涂片和体液直接离心沉淀制作细胞块石蜡切片均有5例查见癌细胞，未查见癌细胞的胸腹水有10例进行了CK、Vimentin、Mesothelial（HBME-1）、CEA、EMA、免疫组织化学染色，对3例查见癌细胞的病例还进行了P170、GST-π、TOPⅡ免疫组织化学染色，显色良好，背景清晰。 结论  体液直接离心沉淀细胞块石蜡切片方法简单，操作步骤少，不易出差错，结果稳定，不需要特殊的材料和设备，可与平常的日常工作一起进行，HE和免疫组织化学染色背景清晰，效果满意，没有琼脂包埋的那种模糊背景，值得推广使用。特别是对于恶性肿瘤胸腹水效果很好。

　　【关键词】  细胞块 石蜡切片 免疫组化

　　利用免疫组织化学染色方法对体液中细胞进行类型鉴别，提高体液内癌细胞病理诊断的准确性和检出率是探讨体液内查找癌细胞的新方法，我院利用此法检测50例报告如下。

　　1.1 材料 选用成都市第五人民医院病理科2004年4～7月所收到的胸腹水50例。800型离心沉淀器，ZT-12P型生物组织自动脱水机，免疫组织化学染色试剂由基因公司提供。

　　1.2 方法 将所收到的体液都进行普通离心涂片和体液直接离心沉淀制作细胞块石蜡切片。

　　体液直接离心沉淀制作细胞块石蜡切片:（1）离心沉淀:将收到的胸腹水立即摇匀后倒入5ml离心管4ml体液离心5min，转速3000r/min ［1］ ，反复进行3～5次。对体液较为清亮的胸腹水需要使用20ml离心管，倒入体液18ml，转速2000r/min，离心时间5min，弃去上清液，再倒入18ml体液反复进行离心10次，再将剩余沉淀物用5ml离心管离心5min，转速4000r/min，如此反复进行多次，尽可能多地从体液中沉淀到足够多的细胞数量。（2）固定:离心完成后弃去上清液倒入10%的中性福尔马林固定2h。（3）脱水、透明、浸蜡:取出沉淀物用双层纱布包裹，进入ZT-12P型生物组织自动脱水机进行脱水，脱水时酒精温度为摄氏45度，75%酒精脱水60min，85%酒精脱水120min，95%酒精脱水120min，无水乙醇Ⅰ脱水90min，无水乙醇Ⅱ脱水90min，无水乙醇Ⅲ脱水90min，二甲苯透明时温度为摄氏45度，二甲苯Ⅰ透明30min，二甲苯Ⅱ透明30min，浸蜡时温度为摄氏60度，石蜡为生物组织切片石蜡，浸蜡Ⅰ60min，浸蜡Ⅱ60min，浸蜡Ⅲ60min（其方法与普通组织一样）。（4）包埋:在包埋时必须将细胞块从多个角度切碎后再进行包埋。这一步很重要，因为细胞在不同的层面分布密度不同。如果不切碎沉淀物包埋，所切的切面有可能细胞数量少或者没有肿瘤细胞分布在该层面。（5）切片:切片厚度为3μm。（6）HE染色步骤:①切片在恒温干燥箱内脱蜡50min，温度为摄氏60度;②）二甲苯Ⅰ脱蜡10min;③二甲苯Ⅱ脱蜡5min;④无水乙醇洗去二甲苯1min×2;⑤95%酒精1min;⑤90%酒精1min;⑦85%酒精1min;⑧自来水洗2min;⑨苏木精染色1min～5min;⑩自来水洗1min;○111%盐酸酒精分化20s ［2］ ;○12自来水1min;○13稀氨水（1%）反蓝30s，自来水洗1min;○14伊红染色1min;○15自来水1min;○1685%酒精脱水20s;○1790%酒精脱水30s;○1895%酒精Ⅰ2min;○1995%酒精Ⅱ1min;○20无水乙醇Ⅰ2min;○21无水乙醇Ⅱ1min ［2］ ;○22切片在恒温干燥箱内干燥15～30min，温度为摄氏60度;○23二甲苯Ⅰ2min ［2］ ;○24一甲苯Ⅱ2min;○25一甲苯Ⅲ1min;○26中性树胶封片，完成制片过程。

　　部分细胞块可根据需要进行免疫组织化学染色，其方法与普通组织免疫组织化学染色相同，在这里使用二步法Envision染色方法:（1）脱蜡，水化组织切片;（2）预处理组织切片;（据一抗具体说明而定―，酶修复或热修复;（3）蒸馏水漂洗，置于PBS中;（4）滴加3%的过氧化氢阻断过氧化物酶，避免孵育30min;（5）蒸馏水漂洗，置于PBS中5min二次;（6）在37摄氏度下一抗孵育120min;（7）PBS漂洗5min二次;（8）在37摄氏度下Envision孵育45min;（9）PBS漂洗5min二次;（10）色源底物溶液DAB显色，光镜控制;（11）蒸馏水漂洗;（12）复染封片（试剂由基因公司提供）。

　　普通离心涂片，将收到的体液使用5ml离心管离心5min，转速3000r/min，弃去上清液，摇心沉淀物，将沉淀物均匀地涂在载玻片上，用乙醇-冰醋酸液固定30min，HE染色。

　　2 结果

　　免疫组织化学染色背景清晰，显色良好。

　　胸腹水普通离心涂片和体液直接离心沉淀制作细胞块 石蜡切片结果见表1。

　　表1 胸腹水普通离心涂片和体液直接离心沉淀制作细胞块石蜡切片结果（略）

　　3 讨论

　　在50例胸腹水中离心涂片和细胞块石蜡切片均在相同的3例内查见癌细胞，该3例阳性均通过组织学切片证实，其余47例通过治疗痊愈，没有使用抗癌药物胸腹水消失。胸腹水离心涂片和细胞块石蜡切片在肿瘤细胞检出方面没有显著差异，但细胞块石蜡切片获得的肿瘤细胞更多，可以进行免疫组织化学染色，免疫组织化学染色背景清晰，显色良好。特别是可以进行耐药基因表达产物的检测，对肿瘤化疗具有重要的帮助。可以通过免疫组织化学染色进行肿瘤细胞分类提高诊断质量。对于退变的间皮细胞和退变的肿瘤细胞有时难以区别，使用免疫组织化学染色标记细胞的类型，可以提高诊断的准确性。用细胞块石蜡切片进行免疫组织化学染色，背景清晰，阳性表达清楚，与组织学切片无明显差别。体液直接离心沉淀细胞块石蜡切片方法简单，操作步骤少，不易出差错，结果稳定，不需要特殊的材料的设备，可与平常的日常工作一起进行，背景清晰，效果满意，没有琼脂包埋的那种模糊背景，值得推广使用。特别是对于恶性肿瘤胸腹水效果很好。

　　参考文献

　　1 邱瑞成.应用超声波快速石蜡技术制作细胞切片.实用医院临床杂志，2004，1（3）:55.

　　2 王伯，李玉松，黄高，等.病理学技术.北京:人民卫生出版社，2000，76-139. 

　　（编辑李 梁）

　　作者单位:611130四川省成都市第五人民医院病理科