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病理组织石蜡切片制作常见问题解析
石蜡切片的制作是病理科检验人员的常规工作之一,也是病理检验的的一个重要环节。组织切片质量好坏直接关系病理诊断的准确性。
制作方法
固定取材
1、临床所取标本要新鲜,否则细胞内溶酶体会破裂,造成细胞自溶。
2、组织固定液多选用10%中性福尔马林,福尔马林最好现配现用。
3、固定液体积要超过标本的10~20倍,否则固定不充分,影响染色。
4、固定标本的容器要以使标本不变形为宜。
脱水
1、乙醇脱水能力较强,常使组织过度收缩和变脆,除根据组织种类、组织块大小和固定剂的不同严格控制脱水时间外,取从低浓度10%乙醇开始逐步升级,组织块中的水分逐渐被脱出,避免因脱水过度引起组织收缩、硬脆、切片时蜡带散裂。
2、在脱水时用滤纸吸去组织块多余的水分,并用吹风机将其吹干,确保各级乙醇的浓度尤其是无水乙醇。
3、根据硫酸铜遇水变蓝的原理,检测无水乙醇内是否有水并及时更换,确保组织脱水彻底。
浸蜡
1、由于蜡箱上部与底部温差是8℃左右,在蜡箱上部放1个温度计,只能显示蜡箱上部的确切温度。为避免温差对组织浸蜡带来不利,通常在蜡箱的中部与底部各放1个温度计显示各部的真实温度,把组织放在蜡箱相适宜的部位内浸蜡。
2、较大的组织在软蜡和硬蜡内的时间要把握好,组织在浸软蜡时可以适当延长时间,在硬蜡内时间不可过长,因为硬蜡内的温度较高;浸蜡总体时间不可太长,否则会引起组织过度收缩、变硬、变脆、切片易碎裂、降低切片质量甚至失败;浸蜡时间也不可过短,否则蜡不能完全浸入组织中,切不出完整的切片。
染色
1、盐酸乙醇分化步骤尤其重要,分化的目的是使胞核染色,而无背景色。
2、明矾苏木精性质使其在酸性溶液中呈现红色,在碱性溶液中呈现蓝色。在盐酸乙醇分化时,切片由深蓝变为粉红色时,应停止分化。
3、分化时,有经验者可以肉眼观察切片至粉红色时终止分化,初学者可镜下多次观察切片,至切片除胞核外,无其他背景着色时,停止分化;或是依据盐酸乙醇浓度,确定分化时间;试剂初配制时,盐酸乙醇浓度高,分化时间短,反之则分化时间延长。。
4、切片分化完成后,将切片移至弱碱性的溶液中返蓝,一般采用自来水,或是温度在50℃的自来水中,因其本身为弱碱性,且取用方便,所以被广泛使用。
封片
1、需吹干或烤干切片上水分,否则镜下观察时有一层白雾,导致细胞轮廓不清楚。
2、病理组织切片HE染色一般采用中性树胶封片,封片时以无气泡为准,否则会影响镜下观察。
3、常用24 ×32 mm大小的盖玻片,只需用一次性的巴氏吸管滴2滴中性树胶即可,过少则致封片不完全,过多则致中性树胶外溢。
问题分析
切片过厚
1、切片机厚薄调节旋钮错误设置
处理方法:检查旋钮,正确调整,一般设定为3~5μm。
2、切片时出现不正当操作(如手腕下压、切刀回拉、切片停顿等)
处理方法:使用规范的操作动作,保证均匀用力,保证切片动作连续。
3、蜡块过软
处理方法:延长蜡块冷冻时间。
切片不完整
1、切片中间密布小孔:常见原因为组织包埋时包埋盒底部存有小气泡或小水珠。
处理方法:较厚组织可以进一步修切到组织最大面,以保证切片完整。
2、切片中间出现空圈:常见原因为组织未脱水完全,自然风干后组织向内凹陷;组织块修切后未及时封蜡,存放一段时间后组织面向内凹陷。
处理方法:较厚组织可以进一步深切,较薄组织则需要溶解后重新包埋切片。
切片跳片
1、刀片没有固定紧
处理方法:①检查刀片,清除刀背的残蜡或其他污物;②进一步拧紧固定刀片的螺丝;③如刀片是靠弹性钢片着力的,则检查钢片弹性是否减弱,可将弹片往外轻微扳动,或直接钢片。
2、组织块没有完全固定牢固
可能的原因:切片刀刀台或组织块夹头的螺丝没有完全拧紧。
处理方法:拧紧刀台和组织块夹头的螺丝。
3、组织块过硬
可能的原因:组织浸蜡、包埋的时间过长,或石蜡的熔点过高;组织块冷冻时间过长。
处理方法:①减少组织块冷冻时间;②切片时可以先将毛巾用漂片水浸湿后,适当热敷于包埋组织表面,或者采用“哈气”的方法处理组织面;③对于肌瘤等富含纤维的致密组织,修切组织块后,可将组织面浸于醋酸溶液(5%)中软化15-30 min,然后再切片;④质地坚韧的组织(如骨组织、肌肉组织等),可将组织包埋蜡块熔化,按脱水、透明的处理程序反方向处理至75 %乙醇,然后取出组织,流水冲洗后放入软化剂中处理 3-4 h(据组织的厚薄调整时间,一般以镊子夹起组织较柔软为宜)。组织软化后经流水冲洗3-4 h,按常规方法制作蜡块后,再行切片。
切片被压缩或起皱褶
1、石蜡不纯或疏松有气泡
处理方法: 选择质量较好的石蜡,并在熔蜡过程中避免气泡形成。
2、皮肤、子宫内膜带肌肉和消化道黏膜带肌肉等特殊组织
处理方法:切片时可将组织质地较硬的部分朝上,如皮肤组织表皮、子宫内膜带肌组织和消化道黏膜带肌组织的肌层朝上。
3、组织浸蜡和包埋用的石蜡硬度不一致
处理方法:检查和更换石蜡。
切片有刀痕或纵裂纹
1、组织块中有钙化或脱钙不全
处理方法:可补充脱钙(5 %盐酸溶液)20-30 min。
2、刀口上沾有杂物
处理方法:切完1个组织块以后,使用毛笔清除刀口污物(由下至上)。
3、组织块中有异物(如缝线、吻合钉等)
处理方法:①可以直接拔出者,可用镊子直接拔出即可;②如不便直接拔出,可按较硬难切组织处理方法处理,但需在软化流水冲洗后,拔出异物。
切片撕裂、散碎、不成片
1、常见原因
①组织取材厚度过厚;②组织处理步骤处理不当;③脱脂不彻底,组织含脂肪过多。
2、处理方法
①组织取材一般为2 mm;②不同的组织采取相应的固定、脱水、透明和浸蜡的操作步骤和时间;③可将组织块放在空气中自然风干 1~2 d 后再切片; ④把锯条或刀片一端放在酒精灯上1 cm 处加热5 s 左右(刀片温度达80℃左右即可),然后将刀片紧贴组织面,可见小气泡溢出,反复几次至气泡完全消失后,再用石蜡将组织块修补好;⑤将组织块于-20 ℃冰箱内冷冻10-20 min,取出后快速切片,并切切片直接放于浸水的载玻片上展片,不经温水漂片。
切片离刀,粘在石蜡块上
1、石蜡过软
处理方法:将组织块适当冷冻一段时间。
2、面上缘的蜡边太少
处理方法:使用毛笔在组织块原位展片,展开后然后再进行其他;若切片仍不能被展开,新包埋组织。