病理组织石蜡切片制作常见问题解析

石蜡切片的制作是病理科检验人员的常规工作之一，也是病理检验的的一个重要环节。组织切片质量好坏直接关系病理诊断的准确性。

制作方法

固定取材

1、临床所取标本要新鲜，否则细胞内溶酶体会破裂，造成细胞自溶。

2、组织固定液多选用10％中性福尔马林，福尔马林最好现配现用。

3、固定液体积要超过标本的10～20倍，否则固定不充分，影响染色。

4、固定标本的容器要以使标本不变形为宜。

脱水

1、乙醇脱水能力较强，常使组织过度收缩和变脆，除根据组织种类、组织块大小和固定剂的不同严格控制脱水时间外，取从低浓度10%乙醇开始逐步升级，组织块中的水分逐渐被脱出，避免因脱水过度引起组织收缩、硬脆、切片时蜡带散裂。

2、在脱水时用滤纸吸去组织块多余的水分，并用吹风机将其吹干，确保各级乙醇的浓度尤其是无水乙醇。

3、根据硫酸铜遇水变蓝的原理，检测无水乙醇内是否有水并及时更换，确保组织脱水彻底。

浸蜡

1、由于蜡箱上部与底部温差是8℃左右，在蜡箱上部放1个温度计，只能显示蜡箱上部的确切温度。为避免温差对组织浸蜡带来不利，通常在蜡箱的中部与底部各放1个温度计显示各部的真实温度，把组织放在蜡箱相适宜的部位内浸蜡。

2、较大的组织在软蜡和硬蜡内的时间要把握好，组织在浸软蜡时可以适当延长时间，在硬蜡内时间不可过长，因为硬蜡内的温度较高；浸蜡总体时间不可太长，否则会引起组织过度收缩、变硬、变脆、切片易碎裂、降低切片质量甚至失败；浸蜡时间也不可过短，否则蜡不能完全浸入组织中，切不出完整的切片。

染色

1、盐酸乙醇分化步骤尤其重要，分化的目的是使胞核染色，而无背景色。

2、明矾苏木精性质使其在酸性溶液中呈现红色，在碱性溶液中呈现蓝色。在盐酸乙醇分化时，切片由深蓝变为粉红色时，应停止分化。

3、分化时，有经验者可以肉眼观察切片至粉红色时终止分化，初学者可镜下多次观察切片，至切片除胞核外，无其他背景着色时，停止分化；或是依据盐酸乙醇浓度，确定分化时间；试剂初配制时，盐酸乙醇浓度高，分化时间短，反之则分化时间延长。。

4、切片分化完成后，将切片移至弱碱性的溶液中返蓝，一般采用自来水，或是温度在50℃的自来水中，因其本身为弱碱性，且取用方便，所以被广泛使用。

封片

1、需吹干或烤干切片上水分，否则镜下观察时有一层白雾，导致细胞轮廓不清楚。

2、病理组织切片HE染色一般采用中性树胶封片，封片时以无气泡为准，否则会影响镜下观察。

3、常用24 ×32 mm大小的盖玻片，只需用一次性的巴氏吸管滴2滴中性树胶即可，过少则致封片不完全，过多则致中性树胶外溢。

问题分析

切片过厚

1、切片机厚薄调节旋钮错误设置

处理方法：检查旋钮，正确调整，一般设定为3~5μm。

2、切片时出现不正当操作（如手腕下压、切刀回拉、切片停顿等） 

处理方法：使用规范的操作动作，保证均匀用力，保证切片动作连续。

3、蜡块过软

处理方法：延长蜡块冷冻时间。

切片不完整

1、切片中间密布小孔：常见原因为组织包埋时包埋盒底部存有小气泡或小水珠。 

处理方法：较厚组织可以进一步修切到组织最大面，以保证切片完整。

2、切片中间出现空圈：常见原因为组织未脱水完全，自然风干后组织向内凹陷；组织块修切后未及时封蜡，存放一段时间后组织面向内凹陷。 

处理方法：较厚组织可以进一步深切，较薄组织则需要溶解后重新包埋切片。

切片跳片

1、刀片没有固定紧

处理方法：①检查刀片，清除刀背的残蜡或其他污物；②进一步拧紧固定刀片的螺丝；③如刀片是靠弹性钢片着力的，则检查钢片弹性是否减弱，可将弹片往外轻微扳动，或直接钢片。

2、组织块没有完全固定牢固

可能的原因：切片刀刀台或组织块夹头的螺丝没有完全拧紧。

处理方法：拧紧刀台和组织块夹头的螺丝。

3、组织块过硬

可能的原因：组织浸蜡、包埋的时间过长，或石蜡的熔点过高；组织块冷冻时间过长。 

处理方法：①减少组织块冷冻时间；②切片时可以先将毛巾用漂片水浸湿后，适当热敷于包埋组织表面，或者采用“哈气”的方法处理组织面；③对于肌瘤等富含纤维的致密组织，修切组织块后，可将组织面浸于醋酸溶液（5%）中软化15-30 min，然后再切片；④质地坚韧的组织（如骨组织、肌肉组织等），可将组织包埋蜡块熔化，按脱水、透明的处理程序反方向处理至75 %乙醇，然后取出组织，流水冲洗后放入软化剂中处理 3-4 h（据组织的厚薄调整时间，一般以镊子夹起组织较柔软为宜）。组织软化后经流水冲洗3-4 h，按常规方法制作蜡块后，再行切片。

切片被压缩或起皱褶

1、石蜡不纯或疏松有气泡

处理方法： 选择质量较好的石蜡，并在熔蜡过程中避免气泡形成。

2、皮肤、子宫内膜带肌肉和消化道黏膜带肌肉等特殊组织

处理方法：切片时可将组织质地较硬的部分朝上，如皮肤组织表皮、子宫内膜带肌组织和消化道黏膜带肌组织的肌层朝上。

3、组织浸蜡和包埋用的石蜡硬度不一致

处理方法：检查和更换石蜡。

切片有刀痕或纵裂纹

1、组织块中有钙化或脱钙不全

处理方法：可补充脱钙（5 %盐酸溶液）20-30 min。

2、刀口上沾有杂物

处理方法：切完1个组织块以后，使用毛笔清除刀口污物（由下至上）。

3、组织块中有异物（如缝线、吻合钉等）

处理方法：①可以直接拔出者，可用镊子直接拔出即可；②如不便直接拔出，可按较硬难切组织处理方法处理，但需在软化流水冲洗后，拔出异物。

切片撕裂、散碎、不成片

1、常见原因

①组织取材厚度过厚；②组织处理步骤处理不当；③脱脂不彻底，组织含脂肪过多。

2、处理方法

①组织取材一般为2 mm；②不同的组织采取相应的固定、脱水、透明和浸蜡的操作步骤和时间；③可将组织块放在空气中自然风干 1~2 d 后再切片； ④把锯条或刀片一端放在酒精灯上1 cm 处加热5 s 左右（刀片温度达80℃左右即可），然后将刀片紧贴组织面，可见小气泡溢出，反复几次至气泡完全消失后，再用石蜡将组织块修补好；⑤将组织块于-20 ℃冰箱内冷冻10-20 min，取出后快速切片，并切切片直接放于浸水的载玻片上展片，不经温水漂片。

切片离刀，粘在石蜡块上

1、石蜡过软

处理方法：将组织块适当冷冻一段时间。

2、面上缘的蜡边太少

处理方法：使用毛笔在组织块原位展片，展开后然后再进行其他；若切片仍不能被展开，新包埋组织。