HPV基因分型检测流程

一、DNA提取

洗脱→1ml洗脱液转移到1.5离心管

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离心→13000rpm  10min

↓去上清

加液→将裂解液加入离心管中，悬浮沉淀  50ul

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裂解→沸水浴或金属浴10min

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离心→13000rpm  10min

↓

保存→保留上清液（即DNA）待用

注：样本DNA，24h内4℃保存，长期-20℃保存

二、PCR扩增

编号→取出PCR管，管盖上编号

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离心→5000rpm  2s

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加样→5ul待测DNA加到PCR管内

↓

离心→5000rpm  2s

↓

扩增→PCR管放入PCR仪，按程序扩增

注：PCR程序设置

  50℃      15min

  95℃      10min

  94℃      30s

  42℃      90s            40循环

  72℃      30s

  72℃      5min

  4℃       HOLD

三、杂交、结果判断

备模→取15ml塑料离心管，放入标有样本编号的模条，

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加液→加入A液5-6ml及所有的PCR标记物

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变性→在沸水浴中加热10min

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杂交→放入杂交箱51℃杂交至少90min

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洗膜→取出模条，移至装有预热B液的50ml离心管中，于51℃轻摇洗涤5min，注：最多可以洗涤5张

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孵育→按A液：POD=2ml:1ul配置孵育液（两张膜需4ulPOD,四张膜可用6ul）室温30min

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摇洗→用A液洗2×5min

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洗膜→用C液洗1-2min

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显色→将模条浸泡于中避光显色至少30min后，转移至去离子水中浸泡即可观察

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判读

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保存

实验结果有效的前提

  实验的每张模条在PC位点必须出现蓝色显色信号

  阴性质控品除PC位点出现显色信号外其余位点均不出现显色信号

  阳性质控品除PC位点出现显色信号外，必须在相应HPV基因型位点出现显色信号