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- HPV基因分型检测流程
HPV基因分型检测流程
一、DNA提取
洗脱→1ml洗脱液转移到1.5离心管
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离心→13000rpm 10min
↓去上清
加液→将裂解液加入离心管中，悬浮沉淀 50ul
↓
裂解→沸水浴或金属浴10min
↓
离心→13000rpm 10min
↓
保存→保留上清液（即DNA）待用
注：样本DNA，24h内4℃保存，长期-20℃保存
二、PCR扩增
编号→取出PCR管，管盖上编号
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离心→5000rpm 2s
↓
加样→5ul待测DNA加到PCR管内
↓
离心→5000rpm 2s
↓
扩增→PCR管放入PCR仪，按程序扩增
注：PCR程序设置
50℃ 15min
95℃ 10min
94℃ 30s
42℃ 90s 40循环
72℃ 30s
72℃ 5min
4℃ HOLD
三、杂交、结果判断
备模→取15ml塑料离心管，放入标有样本编号的模条，
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加液→加入A液5-6ml及所有的PCR标记物
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变性→在沸水浴中加热10min
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杂交→放入杂交箱51℃杂交至少90min
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洗膜→取出模条，移至装有预热B液的50ml离心管中，于51℃轻摇洗涤5min，注：最多可以洗涤5张
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孵育→按A液：POD=2ml:1ul配置孵育液（两张膜需4ulPOD,四张膜可用6ul）室温30min
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摇洗→用A液洗2×5min
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洗膜→用C液洗1-2min
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显色→将模条浸泡于中避光显色至少30min后，转移至去离子水中浸泡即可观察
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判读
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保存
实验结果有效的前提
实验的每张模条在PC位点必须出现蓝色显色信号
阴性质控品除PC位点出现显色信号外其余位点均不出现显色信号
阳性质控品除PC位点出现显色信号外，必须在相应HPV基因型位点出现显色信号
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- 狭路相逢，勇者胜
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