病理常用研究方法-转贴 - 华夏病理网论坛

frankbj 离线: 帖子：106; 粉蓝豆：22; 经验：128; 注册时间：2006-10-06; 加关注 | 发消息

楼主发表于 2006-10-19 22:11|举报|关注(1)
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免疫组织化学染色的基本过程

• 标本的准备

• 标本的固定

• 组织脱水、浸蜡及包埋

• 切片

• 免疫组化染色

组织标本的取材和保存

• 取材时需用锋利器械，避免挤压

• 避开出血坏死区域

• 病灶、交界、正常部位

• 大小约为 1x1x0.2cm

• 及时固定

• 印片法

将新鲜标本沿中心剖开，用载玻片轻压，细胞即黏附于玻片之上。

• 涂片法

常用于淋巴结、软组织、肝、肾、肺等的细针穿刺，如组织较少，将组织推在玻片上，然后用另一玻片轻压涂片。

• 沉淀法

主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等细胞较少的标本。将上述标本的瓶底自然沉淀液约5毫升离心，之后去掉上清，再涂片。

制备细胞玻片需注意

• 在印片或涂片前应涂胶，防止细胞脱落。

• 为节省试剂和便于观察，细胞应集中在直径0.6--1.0cm范围内。

组织和细胞标本的固定

• 使细胞内蛋白质凝固，减少细胞内分解酶的反应，防止细胞自溶。

• 保存组织和细胞内的抗原性，使抗原不失活、不弥散。

抗原分类

• 不稳定性抗原：T淋巴细胞表面抗原等。

• 半稳定性抗原：如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等。

• 稳定性抗原：HBSAg AFP CEA Keratin 、 S－100等。

常用固定液

• 甲醛固定液

10％福尔马林

10％中性福尔马林（含碳酸钙）

10％中性缓冲福尔马林（PBS）

其中以最后一种在免疫组化中最常用。

• 4％多聚甲醛－0.1mol/L磷酸缓冲液

较适用于免疫细胞化学染色。

注意事项

• 组织块大小 2*2*0.5cm

• 组织应及时固定

• 组织固定后必须彻底冲洗，除去残留固定液，一般用PBS缓冲液冲洗

影响固定的因素

• 温度：一般固定剂随温度升高固定能力增强，以室温最常用，某些酶需37度下固定，某些病毒需低温下固定。

• 浓度：10％中性甲醛，4％多聚甲醛最合适，乙醇最常用95％

• 固定时间：视组织块大小，固定液种类、浓度、温度而定。

常用的标记酶

• 辣根过氧化物酶

• 碱性磷酸酶

免疫组织化学方法

• 60年代发展起来的新方法，把抗原抗体免疫反应和酶催化作用结合起来，即吸收了免疫荧光、放射免疫的优点，又克服了它们的缺点。（1）不需要特殊的显微镜观察（2）定位准确，对比度好，染色标本可长期保存（3）可用苏木素等衬染，与形态结构结合观察（4）反应产物易分辨。

• 直接法：将酶结合在抗体上形成酶标记抗体，然后和抗原反应，再与酶的底物反应显色，在抗原抗体反应部位形成棕色或深棕色产物。

• 间接法：将酶标记在第二抗体分子上，一般免疫组化多采用此法。敏感性强

PAP法－过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法

• 抗原和第一抗体结合后，再滴加第二抗体和PAP复合物，最终形成抗原－一抗－二抗－PAP复合物。

• 一抗和PAP复合物中抗HRP抗体必须来自同一动物属。

• PAP敏感性较高，较间接酶标法高20倍。背景染色也比较低。

亲和免疫组织化学技术

• 利用两种物质之间的高度亲和能力而相互结合的化学反应。亲和物不但相互之间有高度亲和力，与一些标记物如荧光素、酶、同位素、胶体金及铁蛋白等也有很强亲和力，从而可用荧光显微镜，酶加底物显色反应、放射自显影或电子显微镜观察。

• 常用的亲和物质包括：生物素、卵白素、植物凝集素、葡萄球菌A蛋白、IgG等。

ABC法

• 生物素与酶结合，形成生物素化HRP，再与卵白素按一定比例混合，形成复合物ABC

• 该复合物再与生物素化抗体结合。

• 具体步骤：特异性一抗与组织中抗原结合形成抗原抗体复合物，生物素化二抗再与一抗反应，最后ABC和生物素二抗结合，形成抗原－抗体－生物素化二抗－ABC

免疫组化相关技术

• 抗原修复

• 酶消化法：如胰酶、蛋白酶

• 对部分抗体而非全部抗体有效。

• 对一些抗体十分必要：如BerEP4，CD21，CD35。

• 如果固定时间过长，可能无效。

• 没有固定的消化时间，需要根据相应组织确定（固定时间越短，消化时间越短）。

•

• 加热法：
水浴，微波，加压煮沸，高压锅，蒸气浴

• 声处理

• 综合使用上述方法

•

• 检测系统

• 显色原的选择

• 抗体的选择

• 对照的使用

• 标准化与自动化

加热法优于酶消化法之处

• 染色结果更为恒定与一致；可以找到几乎适用于所有组织的处理时间。

• 一抗稀释倍数可以更高（省钱）

• 某些抗体只适用于加热法

适用于加热法的部分抗体

如果不加热修复则无

效的抗体

• ER

• PR

• Bcl-2

• TdT

• Ki-67

• cytokeratin

• BerH2/CD30

• LCA/CD45

• L26/CD20

• Chromogranin

• Myeloperoxidase

• CEA

加热法抗原修复的注意事项

• 避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。

• 加热后必须经过冷却（15-30’）（使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型）。

加压煮沸法

• 在非密封的压力锅中煮沸3升缓冲液

• 把切片架放入煮沸的液体中

• 密封压力锅使达到最大压力

• 达到最大压力后开始计算加热时间（推荐时间为2.5分钟；陈旧或固定时间长的标本为3分钟）

• 较微波法更有效
§ 可以同时处理更多的切片
§ 可达到更高的温度，因此更有效 （以更高倍数稀释抗体）
§ 加热均匀（避免了微波冷热不均
的现象）且节省时间

• 可能的缺陷：
质量差的加热锅有可能发生“爆炸”（塑料锅可能用于微波法中更安全？）

抗原修复法中的关键问题

• 充分的抗原修复是影响染色结果最重要的因素：比检测系统本身的敏感性更重要

• 要十分注意以下几个方面：
§ 加热温度
§ 加热时间
否则加热法可能对一些要求较高的抗体无效（如Ki67，PR）

抗原修复法中潜在的问题

• 固定时间较短的组织用较强的修复方法（如加压煮沸法或长时间酶消化）可导致组织形态破坏或组织完全消化

• 解决方法：多次实验选择更短的加热或酶消化时间

内源性生物素：加热法中的难题

• 加热法可以使内源性生物素或生物素样物质活性加强，在卵白素-生物素检测系统中产生假阳性结果。

• 不要把内源性生物素导致的假阳性误为阳性结果。

• 假阳性常为暗褐色，绒毛状或颗粒状（可以色很深），但没有真正的膜阳性。

• 容易受其影响的组织：

§ 肝脏

§ 线粒体丰富的组织，如肾，Hurthle 细胞

§ 胞浆丰富的瘤细胞

• 解决方法：卵白素 -生物素阻断；使用其它检测系统，如PAP， APAAP，EnVision等。

• 多种修复液可供选择：pH6.0的枸橼酸缓冲液（最常用），尿素，Tris-Hcl等。

• 最近研究表明碱性修复液更有效。

• 推荐：Ph8.0，1mM的EDTA缓冲液。可用于大多数适用于加热法的抗体。

• 传统的阳性对照

§ 在每组中设置已
知为阳性的对照。
§ 确保所有试剂均
有效，操作步骤正
确。

• 传统的阴性对照
§ 每例其中的一张切
片由正常血清代替。

§ 目的在于判定非特

异性染色的有无。

免疫组化在诊断中的应用

• 肿瘤鉴别诊断

• 判定癌的可能起源

• 癌症的预后因子

• 证实感染

• 宫内孕的诊断

• 其它 ……

肿瘤的鉴别诊断

• 梭形细胞肿瘤（梭形细胞癌、肉瘤）

• 小圆细胞肿瘤的鉴别（淋巴瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、小细胞癌）

• 透明细胞肿瘤（肾细胞癌、粘液表皮样癌、肌上皮癌、恶性黑色素瘤、印戒细胞癌）

• 其他

常用的抗体

• Pan-cytokeratin——上皮性肿瘤
§ LCA ——淋巴瘤
§ S100 、Melin-A——恶性黑色素瘤

§ Vimentin---------肉瘤

§ NSE、CGA------神经内分泌肿瘤

§ Muscle、Myogenin-----肌源性肿瘤

角蛋白染色注意事项

角蛋白也可表达于非上皮性肿瘤中，这种表达常不规则：

§ 血管肿瘤，尤其是上皮样血管瘤和血
管肉瘤。

              § 淋巴结中单个指突状细胞（不要误为
      转移癌）。
       § 平滑肌或骨骼肌肿瘤
       § 肌纤维母细胞
       § 其它肿瘤

LCA染色注意事项

• 并非所有的淋巴造血系统肿瘤均表达LCA

• 浆细胞瘤常LCA 阴性

• 一些类型淋巴瘤常为阴性
§ 大细胞间变淋巴瘤
§ 淋巴母细胞淋巴瘤

• 如果LCA阴性仍不除外淋巴瘤，补染其它标记物

肿瘤诊断

• 可以对破碎或微小癌甚至不易察觉的病变（胃活检中印戒细胞癌 ）进行诊断
§ 没有免疫组化，诊断或许难以进行。
§ 角蛋白染色可以清晰地显示癌细胞。
§ 寻找异常的染色区域：如不规则的岛状
、条索状结构或正常粘膜中散在单个细胞。

良性还是恶性？
       § B细胞/浆细胞增生性病变，如果出现轻
         链限制性则支持恶性肿瘤。
       § 出现异常免疫表型，如B细胞同时表达
          CD43，CD5或 cyclinD1则支持B细胞淋

              巴瘤的诊断。
       § 除个别例外，任何淋巴组织增生出现
          ALK1表达，均提示大细胞淋巴瘤。

•          良性还是恶性？
增生标记物——Ki67
§ 如果在脑膜瘤、胃肠道间质肿瘤或甲
          状旁腺肿瘤中Ki67 指数很高，提示为
          恶性。
       § Ki67染色可以帮助鉴别萎缩上皮（少
          数细胞阳性）和CINIII（多数细胞阳性）

• 原位病变/良性病变还是恶性
Actin可以清晰地显示乳腺的肌上皮细胞
§ 乳头状瘤与导管内乳头状癌
§ 硬化性腺病与管状腺癌
§ 导管内癌是否有浸润性成分？
§ 导管内癌导致的硬化性腺病还是真正的
浸润性癌？

• 原位病变/良性病变还是恶性
用34BE12（高分子量角蛋白）标记前列腺基底细胞
§ PIN还是浸润性癌？
§ 局灶性不典型腺体或密集腺泡（如腺病或
硬化性腺病）：良性还是前列腺癌

• 是否为肝细胞癌？
§ 肝细胞癌还是腺癌（原发/转
移）？
§ CEA呈小管状阳性被用做肝细胞癌 的诊断依据。

是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤（如颗粒细胞瘤或支持细胞瘤）？
目前有以下几种性索细胞标记物：
Inhibin
CD99
MART-1（黑色素瘤相关标记物）

• 是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤（如颗粒细胞瘤或支持细胞瘤）？
目前有以下几种性索细胞标记物：
Inhibin
CD99
MART-1（黑色素瘤相关标记物）

• 浆膜腔活检或积液诊断中的难题：
§ 反应性间皮细胞还是腺癌？
§ 腺癌还是间皮瘤？
§ 最好的间皮细胞标记物：Calretinin
§ 鉴别诊断中最好的腺癌标记物：BerEP4，
CEA

• 神经内分泌肿瘤的分类
§ 诊断神经内分泌肿瘤必须有明确的全神
经内分泌标记物阳性：Syn和或CgA。

§ 区分类癌与副神经节瘤：前cytokeratin +

，后者可见支持诊断的S100+细胞。

• 淋巴瘤分类
§ 确定瘤细胞谱系：L26 （B细胞），CD3

（T细胞），CD56（NK 细胞）
§ 淋巴母细胞瘤：TdT
§ 套细胞淋巴瘤：Cyclin D1
§ 滤泡性淋巴瘤：CD10 或 bcl-6
§ 间变性大细胞淋巴瘤： CD30，ALK1
§ Burkitt 淋巴瘤：Ki67 （几乎100%细胞阳
性）

胸腺瘤分类
§ 胸腺瘤还是淋巴瘤：Cytokeratin 和 LCA
     最有用
§ 胸腺瘤还是胸腺癌
   1）TdT+淋巴细胞 支持胸腺瘤的诊断。
   2）如果上皮细胞CD5+，支持胸腺癌的诊断。
§ 是否是胸腺瘤：有TdT+性淋巴细胞存在或
    上皮细胞表达CD20，提示为胸腺瘤