楼主 发表于 2006-10-19 22:11|举报|关注(1)

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免疫组织化学染色的基本过程

•          标本的准备

•          标本的固定

•          组织脱水、浸蜡及包埋

•          切片

•          免疫组化染色

组织标本的取材和保存

•          取材时需用锋利器械，避免挤压

•          避开出血坏死区域

•          病灶、交界、正常部位

•          大小约为   1x1x0.2cm

•          及时固定

•          印片法

   将新鲜标本沿中心剖开，用载玻片轻压，细胞即黏附于玻片之上。

 

•          涂片法

   常用于淋巴结、软组织、肝、肾、肺等的细针穿刺，如组织较少，将组织推在玻片上，然后用另一玻片轻压涂片。

•          沉淀法

   主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等细胞较少的标本。将上述标本的瓶底自然沉淀液约5毫升离心，之后去掉上清，再涂片。

制备细胞玻片需注意

•          在印片或涂片前应涂胶，防止细胞脱落。

•          为节省试剂和便于观察，细胞应集中在直径0.6--1.0cm范围内。

组织和细胞标本的固定

•          使细胞内蛋白质凝固，减少细胞内分解酶的反应，防止细胞自溶。

•          保存组织和细胞内的抗原性，使抗原不失活、不弥散。

抗原分类

•          不稳定性抗原：T淋巴细胞表面抗原等。

•          半稳定性抗原：如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等。

•          稳定性抗原：HBSAg  AFP  CEA  Keratin  、 S－100等。

常用固定液

•          甲醛固定液

       10％福尔马林

       10％中性福尔马林（含碳酸钙）

       10％中性缓冲福尔马林（PBS）

       其中以最后一种在免疫组化中最常用。

•          4％多聚甲醛－0.1mol/L磷酸缓冲液

    较适用于免疫细胞化学染色。

注意事项

•          组织块大小  2*2*0.5cm

•          组织应及时固定

•          组织固定后必须彻底冲洗，除去残留固定液，一般用PBS缓冲液冲洗

影响固定的因素

•          温度：一般固定剂随温度升高固定能力增强，以室温最常用，某些酶需37度下固定，某些病毒需低温下固定。

•          浓度：10％中性甲醛，4％多聚甲醛最合适，乙醇最常用95％

•          固定时间：视组织块大小，固定液种类、浓度、温度而定。

常用的标记酶

•          辣根过氧化物酶

•          碱性磷酸酶

免疫组织化学方法

•          60年代发展起来的新方法，把抗原抗体免疫反应和酶催化作用结合起来，即吸收了免疫荧光、放射免疫的优点，又克服了它们的缺点。（1）不需要特殊的显微镜观察（2）定位准确，对比度好，染色标本可长期保存（3）可用苏木素等衬染，与形态结构结合观察（4）反应产物易分辨。

•          直接法：将酶结合在抗体上形成酶标记抗体，然后和抗原反应，再与酶的底物反应显色，在抗原抗体反应部位形成棕色或深棕色产物。

 

•          间接法：将酶标记在第二抗体分子上，一般免疫组化多采用此法。敏感性强

PAP法－过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法

•          抗原和第一抗体结合后，再滴加第二抗体和PAP复合物，最终形成抗原－一抗－二抗－PAP复合物。

•          一抗和PAP复合物中抗HRP抗体必须来自同一动物属。

•          PAP敏感性较高，较间接酶标法高20倍。背景染色也比较低。

亲和免疫组织化学技术

•          利用两种物质之间的高度亲和能力而相互结合的化学反应。亲和物不但相互之间有高度亲和力，与一些标记物如荧光素、酶、同位素、胶体金及铁蛋白等也有很强亲和力，从而可用荧光显微镜，酶加底物显色反应、放射自显影或电子显微镜观察。

•          常用的亲和物质包括：生物素、卵白素、植物凝集素、葡萄球菌A蛋白、IgG等。

ABC法

•          生物素与酶结合，形成生物素化HRP，再与卵白素按一定比例混合，形成复合物ABC

•          该复合物再与生物素化抗体结合。

•          具体步骤：特异性一抗与组织中抗原结合形成抗原抗体复合物，生物素化二抗再与一抗反应，最后ABC和生物素二抗结合，形成抗原－抗体－生物素化二抗－ABC

免疫组化相关技术

•          抗原修复

•          酶消化法：如胰酶、蛋白酶

•          对部分抗体而非全部抗体有效。

•          对一些抗体十分必要：如BerEP4，CD21，CD35。

•          如果固定时间过长，可能无效。

•          没有固定的消化时间，需要根据相应组织确定（固定时间越短，消化时间越短）。

•           

•          加热法：
 水浴，微波，加压煮沸，高压锅，蒸气浴

•          声处理

•          综合使用上述方法

•           

•          检测系统

•          显色原的选择

•          抗体的选择

•          对照的使用

•          标准化与自动化

加热法优于酶消化法之处

•          染色结果更为恒定与一致；可以找到几乎适用于所有组织的处理时间。

•          一抗稀释倍数可以更高（省钱）

•          某些抗体只适用于加热法

适用于加热法的部分抗体

如果不加热修复则无

效的抗体

•           ER

•           PR

•          Bcl-2

•          TdT

•          Ki-67

•            cytokeratin                    •            BerH2/CD30                                   •            LCA/CD45                                       •            L26/CD20                                        •            Chromogranin                                 •            Myeloperoxidase                             •            CEA

加热法抗原修复的注意事项

•          避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。

•          加热后必须经过冷却（15-30’）（使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型）。

加压煮沸法

•          在非密封的压力锅中煮沸3升缓冲液

•          把切片架放入煮沸的液体中

•          密封压力锅使达到最大压力

•          达到最大压力后开始计算加热时间（推荐时间为2.5分钟；陈旧或固定时间长的标本为3分钟）

•          较微波法更有效
  § 可以同时处理更多的切片
  § 可达到更高的温度，因此更有效 （以更高倍数稀释抗体）
  § 加热均匀（避免了微波冷热不均
   的现象）且节省时间

•          可能的缺陷：
  质量差的加热锅有可能发生“爆炸”（塑料锅可能用于微波法中更安全？）

抗原修复法中的关键问题

•          充分的抗原修复是影响染色结果最重要的因素：比检测系统本身的敏感性更重要

•          要十分注意以下几个方面：
  § 加热温度
  § 加热时间
否则加热法可能对一些要求较高的抗体无效（如Ki67，PR）

抗原修复法中潜在的问题

•          固定时间较短的组织用较强的修复方法（如加压煮沸法或长时间酶消化）可导致组织形态破坏或组织完全消化

•          解决方法：多次实验选择更短的加热或酶消化时间

内源性生物素：加热法中的难题

•          加热法可以使内源性生物素或生物素样物质活性加强，在卵白素-生物素检测系统中产生假阳性结果。

•          不要把内源性生物素导致的假阳性误为阳性结果。

•          假阳性常为暗褐色，绒毛状或颗粒状（可以色很深），但没有真正的膜阳性。

•          容易受其影响的组织：

              § 肝脏

              § 线粒体丰富的组织，如肾，Hurthle 细胞

              §  胞浆丰富的瘤细胞

 

•          解决方法：卵白素 -生物素阻断；使用其它检测系统，如PAP， APAAP，EnVision等。

•          多种修复液可供选择：pH6.0的枸橼酸缓冲液（最常用），尿素，Tris-Hcl等。

•          最近研究表明碱性修复液更有效。

•          推荐：Ph8.0，1mM的EDTA缓冲液。可用于大多数适用于加热法的抗体。

•           传统的阳性对照                                                 § 在每组中设置已   知为阳性的对照。                                § 确保所有试剂均   有效，操作步骤正    确。

•           传统的阴性对照 § 每例其中的一张切   片由正常血清代替。   § 目的在于判定非特     异性染色的有无。

免疫组化在诊断中的应用

•          肿瘤鉴别诊断

•          判定癌的可能起源

•          癌症的预后因子

•          证实感染

•          宫内孕的诊断

•          其它 ……

肿瘤的鉴别诊断

•          梭形细胞肿瘤（梭形细胞癌、肉瘤）

•          小圆细胞肿瘤的鉴别（淋巴瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、小细胞癌）

•          透明细胞肿瘤（肾细胞癌、粘液表皮样癌、肌上皮癌、恶性黑色素瘤、印戒细胞癌）

•          其他

常用的抗体

•          Pan-cytokeratin——上皮性肿瘤
  § LCA ——淋巴瘤
  § S100 、Melin-A——恶性黑色素瘤

            § Vimentin---------肉瘤

            § NSE、CGA------神经内分泌肿瘤

            § Muscle、Myogenin-----肌源性肿瘤

 

角蛋白染色注意事项

角蛋白也可表达于非上皮性肿瘤中，这种表达常不规则：

              § 血管肿瘤，尤其是上皮样血管瘤和血
      管肉瘤。

              § 淋巴结中单个指突状细胞（不要误为 
      转移癌）。
       § 平滑肌或骨骼肌肿瘤
       § 肌纤维母细胞
       § 其它肿瘤

LCA染色注意事项

•          并非所有的淋巴造血系统肿瘤均表达LCA

•          浆细胞瘤常LCA 阴性

•          一些类型淋巴瘤常为阴性
  § 大细胞间变淋巴瘤
  § 淋巴母细胞淋巴瘤

•          如果LCA阴性仍不除外淋巴瘤，补染其它标记物

肿瘤诊断

•          可以对破碎或微小癌甚至不易察觉的病变（胃活检中印戒细胞癌 ）进行诊断
§ 没有免疫组化，诊断或许难以进行。
§ 角蛋白染色可以清晰地显示癌细胞。
§ 寻找异常的染色区域：如不规则的岛状
  、条索状结构或正常粘膜中散在单个细胞。

 

良性还是恶性？
       § B细胞/浆细胞增生性病变，如果出现轻
         链限制性则支持恶性肿瘤。
       § 出现异常免疫表型，如B细胞同时表达
          CD43，CD5或 cyclinD1则支持B细胞淋

              巴瘤的诊断。
       § 除个别例外，任何淋巴组织增生出现
          ALK1表达，均提示大细胞淋巴瘤。

•          良性还是恶性？
增生标记物——Ki67
  § 如果在脑膜瘤、胃肠道间质肿瘤或甲 
          状旁腺肿瘤中Ki67 指数很高，提示为
          恶性。
       § Ki67染色可以帮助鉴别萎缩上皮（少
          数细胞阳性）和CINIII（多数细胞阳性）

•          原位病变/良性病变还是恶性
  Actin可以清晰地显示乳腺的肌上皮细胞
  § 乳头状瘤与导管内乳头状癌
  § 硬化性腺病与管状腺癌
  § 导管内癌是否有浸润性成分？
  § 导管内癌导致的硬化性腺病还是真正的
     浸润性癌？

•          原位病变/良性病变还是恶性
用34BE12（高分子量角蛋白）标记前列腺基底细胞
  § PIN还是浸润性癌？
  § 局灶性不典型腺体或密集腺泡（如腺病或
    硬化性腺病）：良性还是前列腺癌

•          是否为肝细胞癌？
  § 肝细胞癌还是腺癌（原发/转
     移）？
  § CEA呈小管状阳性被用做肝细胞癌  的诊断依据。

是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤（如颗粒细胞瘤或支持细胞瘤）？
目前有以下几种性索细胞标记物：
  Inhibin
  CD99
  MART-1（黑色素瘤相关标记物）

•          是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤（如颗粒细胞瘤或支持细胞瘤）？
目前有以下几种性索细胞标记物：
  Inhibin
  CD99
  MART-1（黑色素瘤相关标记物）

•          浆膜腔活检或积液诊断中的难题：
  § 反应性间皮细胞还是腺癌？
  § 腺癌还是间皮瘤？
  § 最好的间皮细胞标记物：Calretinin
  § 鉴别诊断中最好的腺癌标记物：BerEP4，
          CEA

•          神经内分泌肿瘤的分类
  § 诊断神经内分泌肿瘤必须有明确的全神
          经内分泌标记物阳性：Syn和或CgA。

       § 区分类癌与副神经节瘤：前cytokeratin +

              ，后者可见支持诊断的S100+细胞。

•          淋巴瘤分类
 § 确定瘤细胞谱系：L26 （B细胞），CD3

      （T细胞），CD56（NK 细胞）
 §  淋巴母细胞瘤：TdT
 § 套细胞淋巴瘤：Cyclin D1
 § 滤泡性淋巴瘤：CD10 或 bcl-6
 § 间变性大细胞淋巴瘤： CD30，ALK1 
 § Burkitt 淋巴瘤：Ki67 （几乎100%细胞阳
   性）

胸腺瘤分类
 §  胸腺瘤还是淋巴瘤：Cytokeratin 和 LCA
     最有用
 § 胸腺瘤还是胸腺癌
   1）TdT+淋巴细胞 支持胸腺瘤的诊断。
   2）如果上皮细胞CD5+，支持胸腺癌的诊断。
 § 是否是胸腺瘤：有TdT+性淋巴细胞存在或
    上皮细胞表达CD20，提示为胸腺瘤

•          胃肠道间质肿瘤分类
 § 胃肠道间质肿瘤：最常见的表型：c-kit+，  actin-，desmin-
 § 平滑肌肿瘤：c-kit-，actin+，desmin+
 § 雪旺氏瘤：c-kit-，actin-，desmin-，
     S100+

•          软组织肿瘤分类（标记物非常有限）

        § 纤维组织细胞瘤没有可靠的标记物  
 § S100：神经鞘瘤
 § EMA：滑膜肉瘤
 § Actin，desmin：肌源性肿瘤
 § Cytokeratin：滑膜肉瘤，上皮样肉瘤，横
   纹肌样瘤

•          软组织肿瘤分类
 § CD31：血管肿瘤 
  § CD34：血管肿瘤，孤立性纤维瘤，

          DFSP， 血管周细胞瘤，梭形细胞脂肪瘤 
  § Syn：  PNET
  § CD99：尤文氏肉瘤/PNET

•          分期
淋巴结或骨髓中检测出微小转移灶，

  提示预后不良：

判定癌瘤原发部位的
免疫组化标记物

•          器官特异性标记物：
 § 甲状腺球蛋白：甲状腺
 § 降钙素：甲状腺
 § PSA或PAP：前列腺
 § 表面活性物质：肺
 § BRST-2/GCDFP-15：乳腺
 § HEP-PAR1：肝

判定腺癌原发部位的
免疫组化标记物

•          CK7：除胃肠道外，大多数腺癌均为阳性表达

•          CK20：仅胃肠道 和女性生殖道腺癌、粘液腺癌为阳性表达。

•          PE-10（表面活性物质）：50%肺腺癌阳性

•          TTF-1（甲状腺转录因子-1）：80%以上肺腺癌阳性

•          CA125：阳性表达提示女性生殖道起源 （偶尔肺、乳腺、胰管胆管 癌可呈阳性表达）

•          BREAT-2（GCDFP-15）：50%乳腺癌阳性

•          甲状腺球蛋白：甲状腺起源

•          PSA：前列腺起源

判定鳞癌原发部位的免疫组化标记物

•          由于不同部位的鳞癌不表达不同表型，因此没有太多可用的标记物.

•          CD5：阳性表明胸腺起源

•          CD20：阳性提示膀胱移行细胞癌

•          原位杂交检测EB病毒：阳性提示鼻咽癌或EB 相关癌

判定小细胞癌原发部位的
免疫组化标记物

有几种可用的标记物：
 § CK20：Merkel细胞癌为阳性（原发涎腺肿
    瘤也可阳性）
 § TTF-1：原发肺小细胞癌阳性

癌预后因子

•          激素受体：乳腺癌

•          增殖标记物（Ki67）是某些肿瘤的预后因子

•          癌基因与抑癌基因产物:c-erbB2, Rb,p16, p27, p21, ALK1.

ER/PR 判断标准：
≥5%/ 预后好（Favorable）
1-4% 交界性 （Borderline）
阴性/预后差（Negative/Unfavorable

确定感染

•          免疫组化可判定某些感染的实质 （有时病毒包含体难以发现）
 Herpes
 CMV
 HPV
 HBsAg
 Pneumocystis

宫内孕的诊断

•          宫腔刮出物中证实有胎儿成分可有效的排除输卵管妊娠。

•          如果不见绒毛，角蛋白染色可显示蜕膜细胞中的滋养叶细胞，从而证实为宫内孕

 

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