北京地坛医院病理科 滕晓英博士

用Trizol从石蜡组织中提取RNA的方法

实验前需要准备的试剂
   氯仿、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水。

操作步骤
    1. 切片、脱蜡及消化
    a. 将10张5μm厚连续切片（切片机和刀片均经75%乙醇溶液消毒2次）的蜡膜放于2ml的消毒离心管里，加入1.5ml 二甲苯，55℃孵育10min，室温9000r/min离心8min，重复一次。
    b. 加入1.5ml无水乙醇室温放置10min，4℃9000r/min离心8min，重复2次，弃上清。
   c. 加细胞裂解液250μl，混匀，加蛋白酶K 50μl，55℃水浴过夜。
   d. 95℃ 7min灭活蛋白酶K，4℃ 8000r/min离心，弃沉淀。
   e. 加入1ml TRIzol。

    2．分层（Phase Separation）
    a. 样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。
    注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。
    b. 每1ml TRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相。

    3．RNA沉淀（RNA Precipitation）
    a. 4℃ 12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（通常可吸取550μl）转移到新管中。
    注：小心吸取水相，千万不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染。
    b. 在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃ 12,000 rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。

   4．RNA漂洗（RNA Wash）
    a. RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇（用RNase-free水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75％乙醇。
    b. 4℃ 5,000-8,000 rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置1-2分钟晾干沉淀。
    注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
    5. 溶解RNA（Redissolving the RNA）
    沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。

注意事项
    1. 经常更换手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
    2.  RNA在TRIzol试剂中不会被RNase污染，但在氯仿分相后的上清中已经没有了RNase的抑制剂，所以分相后的所有操作要特别小心，保证使用的离心管和枪头都是RNase-free的。
    3. RNase-free水的配制方法：将水加入干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌；RNase-free的塑料和玻璃器皿处理方法：玻璃器皿可在150℃烘烤4小时；塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用DEPC水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。