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请教!两年前的蜡块做EGFR和K-RAS突变检测,PCR没有扩出条带???

redsnow007 离线

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楼主 发表于 2009-06-07 22:22|举报|关注(0)
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最近用07年的石蜡标本做基因突变检测,DNA抽提浓度可以,但PCR出的是SMEAR带,请各位高手出出招,超过2年以上的标本能不能做出来,还需要改善哪些条件???

谢谢!

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lilybc 离线

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1 楼    发表于2009-09-03 09:56:00举报|引用
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 超过两年的蜡块做PCR应该是没有问题的,关键是这个蜡块当时制备时是否有及时固定:

你先看看在HE下形态如何,是否固定不好。

如果形态不错,当时的IHC也好,那就应该可以固定情况还可以,就更有信心了。

接下来就是要改进提取DNA的条件了,看看是否DNA提取有问题,你测的DNA浓度是用什么办法?有没有跑胶?

最后当然就是PCR条件了,你的PCR反应体系是否成熟也很关键。

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chinaroc 离线

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2 楼    发表于2009-09-05 19:31:00举报|引用
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 看看自己的引物吧,应该不是组织的问题。
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用心做事、真情做人!

锤峰 离线

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3 楼    发表于2009-09-05 20:25:00举报|引用
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 应该不是组织的问题。
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zhaodong004 离线

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4 楼    发表于2010-01-24 19:11:00举报|引用
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 DNA在符合要求的石蜡包埋的样本中保存的还是很稳定的,我们5年内的样本都没问题。

PCR 没有扩增出来1.是和您的样本提取的DNA的含量和纯度有关,DNA提取之后一定要用可靠的核酸测定仪进行纯度和含量检测。检测纯度是避免由于DNA中含有的蛋白和RNA污染对PCR的影响,浓度的检测是为了确定PCR中加入的模板量,模板量过多或过少都会影响PCR的成功。2.是和您的引物有关,有些引物扩增效率高,有的低,您需要从几对引物中选一对扩增效率高的。一般您检测的基因小于1KB的话,DNA在石蜡里面的损伤不是主要考虑的因素。当然,如果样本不是符合要求的石蜡包埋的样本,例如没有用中性福尔马林固定,或接触过酸等,这样的样本DNA损伤大,可能也会P不出条带类。

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基本上就是这个样子!
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