敬佩丁老师！
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- 从自信到自以为是，我的一个错误
2007年，一个偶然的机会，我发现有家医院的免疫组化结果：Ki-67，P53，ER、PR等阳性细胞数有点少，大概只有30-40%，如果是一二例，结果应该没问题，然而一年以来都是这样，而CK、EMA、CD20、CD79a、CD45，CD45ORO等浆与膜表达的标记很好，感觉告诉我那里出问题了。他的操作过程是：
1、脱蜡至水
2、甲醇双氧水阻断。
3、蒸馏水洗
4、用电磁炉最大档或中档加热，因处理片子不多，在高压锅里放上蒸馏水，里面放一500ml烧杯，烧杯里放300ml 柠檬酸ph6. 0抗原修复液，把片子放在烧杯里。加热戴帽出气后3分钟，关闭电磁炉。
5、自来水冲高压锅快速冷却，打开高压锅盖，用冷水慢慢冲入高压锅内至冷。
6、蒸馏水洗
7、缓冲液洗三道
8、加一抗（37℃孵育60分钟）
9、蒸馏水洗，缓冲液洗三道
10、加检测系统（37℃孵育30分钟）
11、蒸馏水洗，缓冲液洗三道
12、DAB显色。
问题出在那呢？那只有一条一条去排除。
一、碰到这样的情况我本应该首先考虑是不是一抗出问题了，但他们用了一年，一抗换了几次了，所以我想是不是组织处理导致其些抗原丢失了。所以，让他切了几张片子，我拿回自己科室做了一下，发现阳性率在80-90%左右，也就是说组织是没有问题的。
二、要考虑一抗是不是有问题，如果是原液，应该考虑稀释比对不对，如果是即用型，应该考虑有效期、厂家有没有配正确、运输过程中有没有出现意外等。用其的一抗与我们的检测系统配合，实验结果阳性很好，一抗没有问题。
三、考虑检测系统有没有问题，不同的检测系统，敏感度不同，相对应的一抗浓度也不相同，要考虑检测系统与一抗浓度是否相配，同时也要考虑质量有没有问题。用其的检测系统与我们的一抗相配，与他自己的一抗相配，实验结果阳性也很好，检测系统没有问题。
四、抗原修复有没有问题？抗原修复液是否有效？pH值是否正确？高压锅有没有问题？结果都没有问题。
五、缓冲液是否有问题？是否因为蒸馏水pH值不对？结果都没问题。
六、DAB有没有问题？结果没有。
七、技术员操作有问题？我亲自到他们科室去做，结果和他做的一样，回到我科室又好了。
能想的问题都想到了，那还有什么我们没有想到的呢？
唯一区别的只有加热工具了，我们用电炉加热，他们用电磁炉，从理论上说，不管什么样的加热工具，只要能达到温度，高压锅出气戴帽后，里面的温度是恒定的。抗原修复应该与温度与时间相关。抱着试一下的心态用让他用电炉试了一下，没想到问题出现了。
是电磁炉的原因，我很兴奋，终于解决了，是什么原因呢？我特意买了只电磁炉，从400W开始到2100W，每一档都用了二十几个抗体做了实验，并与电炉作比较：发现凡膜与浆的抗体基本没有差异，而核抗原随着电磁炉的功率的增加，阳性细胞数减少，阳性强度降低。我重复了十几次，结果都是一致的，问另一个用电磁炉修复的医院，方法也和前面医院的相同，结果也一样，换了电炉后问题也就解决了。
我相信自己已经找到问题的所在，是电磁炉的原故，那什么原因呢？为什么只出现在抗里呢？我上网查了一下，发现有十几万篇有关电磁波对DNA损伤的论文，是不是电磁波破坏了DNA，从而损伤了抗体的活性呢？如果是这样，那就解释得通为什么功率越大，阳性细胞越少。于是，我写了篇文章，有关电磁炉对抗免疫组化的影响，但有些大医院的技术员说他们也用电磁炉，没有发现这种现象。我充分相信自己的结论，因为这是一年以来用电磁炉后存在的现象，自己做了十几遍重复性在100%。总认为他们肯定没有做过与电炉的对照，而且，电磁炉对核抗原的影响只是细胞的减少，并不是完全没有，具有欺骗性，他们没有发现而以。一年来，我总是相信自己的结论，对别人的意见不予理睬，因为没有人告诉我他们做过对照。
然而，多次与梁英杰老师交流，他说他们曾做过实验，电磁炉与微波炉比较，电磁炉比微波炉强，想起一年来别人的不同意见，这让我对我的实验产生了怀疑。中华病理杂志的霍临明老师告诉我实验要严谨，让我彻底冷静下来。那问题到底出在那呢？
1、脱蜡至水
2、甲醇双氧水阻断。
3、蒸馏水洗
4、用电磁炉最大档或中档加热，因处理片子不多，在高压锅里放上蒸馏水，里面放一500ml烧杯，烧杯里放300ml 柠檬酸ph6. 0抗原修复液，把片子放在烧杯里。加热戴帽出气后3分钟，关闭电磁炉。
5、自来水冲高压锅快速冷却，打开高压锅盖，用冷水慢慢冲入高压锅内至冷。
6、蒸馏水洗
7、缓冲液洗三道
8、加一抗（37℃孵育60分钟）
9、蒸馏水洗，缓冲液洗三道
10、加检测系统（37℃孵育30分钟）
11、蒸馏水洗，缓冲液洗三道
12、DAB显色。
问题出在那呢？那只有一条一条去排除。
一、碰到这样的情况我本应该首先考虑是不是一抗出问题了，但他们用了一年，一抗换了几次了，所以我想是不是组织处理导致其些抗原丢失了。所以，让他切了几张片子，我拿回自己科室做了一下，发现阳性率在80-90%左右，也就是说组织是没有问题的。
二、要考虑一抗是不是有问题，如果是原液，应该考虑稀释比对不对，如果是即用型，应该考虑有效期、厂家有没有配正确、运输过程中有没有出现意外等。用其的一抗与我们的检测系统配合，实验结果阳性很好，一抗没有问题。
三、考虑检测系统有没有问题，不同的检测系统，敏感度不同，相对应的一抗浓度也不相同，要考虑检测系统与一抗浓度是否相配，同时也要考虑质量有没有问题。用其的检测系统与我们的一抗相配，与他自己的一抗相配，实验结果阳性也很好，检测系统没有问题。
四、抗原修复有没有问题？抗原修复液是否有效？pH值是否正确？高压锅有没有问题？结果都没有问题。
五、缓冲液是否有问题？是否因为蒸馏水pH值不对？结果都没问题。
六、DAB有没有问题？结果没有。
七、技术员操作有问题？我亲自到他们科室去做，结果和他做的一样，回到我科室又好了。
能想的问题都想到了，那还有什么我们没有想到的呢？
唯一区别的只有加热工具了，我们用电炉加热，他们用电磁炉，从理论上说，不管什么样的加热工具，只要能达到温度，高压锅出气戴帽后，里面的温度是恒定的。抗原修复应该与温度与时间相关。抱着试一下的心态用让他用电炉试了一下，没想到问题出现了。
是电磁炉的原因，我很兴奋，终于解决了，是什么原因呢？我特意买了只电磁炉，从400W开始到2100W，每一档都用了二十几个抗体做了实验，并与电炉作比较：发现凡膜与浆的抗体基本没有差异，而核抗原随着电磁炉的功率的增加，阳性细胞数减少，阳性强度降低。我重复了十几次，结果都是一致的，问另一个用电磁炉修复的医院，方法也和前面医院的相同，结果也一样，换了电炉后问题也就解决了。
我相信自己已经找到问题的所在，是电磁炉的原故，那什么原因呢？为什么只出现在抗里呢？我上网查了一下，发现有十几万篇有关电磁波对DNA损伤的论文，是不是电磁波破坏了DNA，从而损伤了抗体的活性呢？如果是这样，那就解释得通为什么功率越大，阳性细胞越少。于是，我写了篇文章，有关电磁炉对抗免疫组化的影响，但有些大医院的技术员说他们也用电磁炉，没有发现这种现象。我充分相信自己的结论，因为这是一年以来用电磁炉后存在的现象，自己做了十几遍重复性在100%。总认为他们肯定没有做过与电炉的对照，而且，电磁炉对核抗原的影响只是细胞的减少，并不是完全没有，具有欺骗性，他们没有发现而以。一年来，我总是相信自己的结论，对别人的意见不予理睬，因为没有人告诉我他们做过对照。
然而，多次与梁英杰老师交流，他说他们曾做过实验，电磁炉与微波炉比较，电磁炉比微波炉强，想起一年来别人的不同意见，这让我对我的实验产生了怀疑。中华病理杂志的霍临明老师告诉我实验要严谨，让我彻底冷静下来。那问题到底出在那呢？
经过一天二夜的冥思苦想，我终于想到了自己实验出现这种结果的原因，是一个从来都认为不可能有区别的地方。通过反复实验，证明这种想法是正确的。
| 就是高压锅里再用烧杯的原因，由于电磁炉加热太快，烧杯内的温度与高压锅内的液体温度不能同步，导致必须使用高温修复的抗原修复时间不够，功率越大，加热速度越快，切片修复的时间也越短，抗原暴露也越差，而用电炉加热较慢，有足够的时间让杯里的水温升高，也就没有这种情况。所以电磁炉抗原修复应该直接将缓冲液放入高压锅内，而且结果与功率无关。一种巧合，正好这些需要高温修复的抗原大多是核抗原，让我误认为电磁波对核抗原有影响，而国外对电磁波对人的影响很重视，电磁波的确对活体的DNA损伤很严重，而且我的实验结果又很稳定，所以我一直坚持自己的错误观点。 我以前一直认为抗原高温修复主要是高压出气后的三分钟，我做过测试，高压出气后1分钟，拿去帽子，测了一下里面烧杯的温度，和锅内的是一致的，所以说，从升温到戴帽这段时间也很重要，保证高压下一致温度3分钟也但重要，只有保证一定的时间后，抗原才能暴露，具体差异在那？时间要多长？我也说不清。用电炉，直接与间接结果是一样的；用电磁炉，最低功率时，直接与间接结果也差不多。以后注意一下直接与间接相同总共需要多少时间。 |
| 具体问题的关键应该是在烧杯中的温度是否能保证在3分钟内保持120度。 |
为什么一年多来，面对别人的不同意见我会如此自以为是，总认为自己是对的，如果早一点重视，一个错误的观点也不会坚持了一年多。这是过于自信了，这就象很多的技术员总觉得自己做的不错，自己做的就是正确的，对别人的意见听不进，特别是有大医院的和有点年纪的，就象我。
虚心使人进步，骄傲使人落后，重视别人不同意见，接受别人的看法，才能使自己少走弯路，才能使自己不断进步，这需要勇气和智慧。
我把这句话作为新年祝词，与朋友们共勉。
虚心使人进步，骄傲使人落后，重视别人不同意见，接受别人的看法，才能使自己少走弯路，才能使自己不断进步，这需要勇气和智慧。
我把这句话作为新年祝词，与朋友们共勉。
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本帖最后由 dingwei 于 2012-07-12 08:03:25 编辑
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zhenni0927 离线
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丁老师的学者风范和求实的态度值得学习！
尽管分子生物学的技术方法很多；但是，免疫化学(IHC&ICC)和原位分子杂交(CISH&FISH)两类技术是构成现代病理分子形态学基础。从原理和操作层面来看，IHC&ISH的确简单，原理一通百通，检测显色标准化。还不像传统组织化学或特染，一套染色一套理论来得复杂，IHC在开发应用新抗体时，既便做不出来，还可玩玩魔术，想办法修复修复抗原，哪怕其间历经千变万化的磨难，或许终究还有点结果。若是ISH，不管探针多好和序列多特异，都毫无办法，核酸降解后连“修复”的机会都不存在。所以，开展分子病理最根本的问题还是抗原和核酸保存的问题，如果这个问题得到根本解决，将是如虎添翼。
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