余挽澜 管域 （湖南常德市第一中医院病理科）

随着医学的发展，传统的纯形态病理学诊断和研究已不能满足日益增长的临床需要，如今分子诊断技术已经作为一种常规病理学诊断技术在很多医院病理科得以开展。我科也于今年6月初在福州泰普生物科技有限公司的帮助之下开展了HPV-DNA原位杂交检测。在短短的几个月的实践中，遇到了不少技术上的问题，都得到泰普公司的热心指导。经过反复实践，现已非常熟练的掌握了原位杂交技术，能够做出非常漂亮的阳性片了。下面谈谈我们这几个月原位杂交试验过程中的体会。

  在我们科，免疫组化已经开展好几年了，有了一些经验。但原位杂交还没有接触过，当初在周小鸽主任哪儿学习免疫组化时认为原位杂交技术距离我们基层医院太遥远了，也就根本没有考虑要学习他，但想不到这么快我们也要开展这项技术了。现在原位杂交的实验条件都准备好了，那就开始吧。虽然以前没有开展此项检查，但平时还是很关注这项技术的，多少还是有些了解。仔细阅读说明书，试验过程和免疫组化差不多，只不过后面多几步而已，开始觉得很简单，可真正要做出一张合格的片子发现不那么容易。第一次操作按照说明书上的步骤，一步一步的来，做出来的结果全为阴性，可是所选的病例在组织切片上都有较为典型的HPV感染的组织学改变，一定有假阴性的存在。我们仔细分析每一步操作过程，在否定了切片脱蜡不彻底和DAB显色时间不够的原因后，想到可能杂交中微波加热过程中有问题，没有把微波打倒高档位置。于是第二次做的时候特别注意这一步骤，可事与愿违，依旧是阴性。以后又作过几次，均就阴性。接二连三的失败打击，我们有些丧失了信心，并一度怀疑探针有问题。正当一筹莫展的时候，泰普公司打来电话回访了，于是我们将试验中遇到的问题提了出来。泰普公司非常重视，公司技术人员同我们进行了沟通，对我们的每个操作步骤详细进行了分析总结，最终把问题的源头指向了杂交的温度，因为杂交温度未达到所需温度会引起阳性信号弱，而导致出现假阴性。最后公司鼓励我们再试一次，并且承诺补偿我们先前所消耗的探针并寄来了阳性片来作对比。事实正是如此，经查我们的恒温干燥箱正好温度调定装置有点问题，要比设置的温度调高5度才能达到37℃。经过调整杂交温度后终于作出来阳性片。

阳性片是作出来了，但紧接着就出现了另一个棘手的问题，背景颜色太深。不该阳的地方，也是一片黄色。阳过头了！仔细回想其中关键的步骤也没什么问题啊，干片？杂交时间过长？都不可能。我们还是联系了公司，请求他们的帮助，当知道我们的问题后，并仔细询问我们操作中的细节，起初我们是担心PBS缓冲液，因为我们用的是做免疫组化染色用的PBS缓冲液，可技术人员说，按照公司的制片经验，可以用，没问题。那最后只有PBS缓冲液温度了和洗涤时间了，洗涤时缓冲液的温度可能没有保证，温度控制的不是很好，多低于48℃，洗涤时间过短，导致洗涤不充分也是一个重要原因。通过利用恒温水浴箱保证PBS缓冲液温度，保证洗涤时间达到充分洗涤的目的，背景颜色过深的问题也解决了。

不知不觉我们开展原位杂交技术快半年了，在这半年里我们学到了不少，从不会到非常熟练的掌握这门技术，检测病例也在不断增加，这些都是我们科室全体人员和泰普公司的共同努力的结果。在这里我们真诚地感谢泰普公司给我们的技术支持和帮助。

原位杂交方法掌握并不难，但细节是关键，不容忽视。

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