HER-2 CISH操作程序

1、预处理

a、脱蜡：二甲苯脱蜡至无水乙醇，双蒸水洗2min×3（若不立刻进入下一步，则切片在无水乙醇中浸泡3次后，空气自然干燥，无需双蒸水洗片）。

b、热预处理（CISH实验成功的关键步骤）：将烧杯中的预处理液放在电加热器或高压锅里加热（≥98℃）或煮沸，盖盖防止缓冲液蒸发。将载有切片的切片架放入已加热或沸腾的预处理溶液中，盖盖，继续加热或煮沸15min。将切片架立刻转移到盛有双蒸水（室温）的容器中，洗2min。 

c、酶消化（CISH实验成功的关键步骤）：对于大多数乳腺组织，室温下酶消化10分钟可获得最佳的CISH结果。根据组织类型和固定方法，可能酶消化时间5－15min。

将酶消化液（试剂B）复温至室温（15－30℃），滴加在切片上，室温孵育10min。双蒸水洗涤，2min×3。梯度乙醇脱水：70%乙醇 2min 85%乙醇 2min 95%乙醇 2min 100%乙醇 2min 100%乙醇 2min。空气自然干燥≥20分钟。

2、变性和杂交 

a、适量HER2探针（试剂C）加到22×22 mm盖玻片中心。将带有探针的盖玻片，探针侧向下，盖在切片上组织样本的适当区域。

b、原位杂交用橡胶水泥封盖玻片以防探针蒸发。

c、探针变性，94－95℃孵育切片5min。切片37℃孵育＞10个hour（过夜）。

3、严格洗涤

a、SSC缓冲液（试剂D）放入两个染色缸内，一个置于室温，另一个在水浴箱中预热到70℃。将杂交后的切片取出，小心去除封片胶，取下盖玻片。 切勿让组织切片干燥。

b、切片置室温SSC的染片缸内快速洗涤后，移入70℃SSC染片缸内洗5min。蒸溜水洗 2min×3

4、免疫显色

a、切片入3%H2O2甲醇溶液10min，PBS／吐温20（0.01%）洗2min×3

b、加适量CAS－BlockTM（试剂F），室温孵育 10min

c、吸去阻断剂。切勿冲洗。加小鼠抗地高辛抗体（试剂G）适量，室温孵育，30min

d、PBS／吐温20（0.01%）洗，2min×3

e、加适量HRP多聚酶的抗小鼠抗体（试剂H），室温孵育，30min

f、PBS／吐温20（0.01%）洗，2min×3

g、加适量稀释好的底物显色液（DAB），室温孵育，30min

h、自来水冲洗，2min，苏木素（试剂J）复染8－10sec，复染时间因不同组织而异。复染不宜过深，以免掩盖信号。

i、自来水冲洗，2min，梯度乙醇脱水（70%、85%、95%、100%、100%）各2min ，二甲苯透明，各2min×2

j、用HistomountTM封片胶（试剂K）封片。

5、光镜观察

40倍光镜观察