前程(12345678) 11:22:35

各位老师你们好：

        我是一名试验人员，最近我要做小鼠胚胎神经系统的石蜡切片，我想经过HE染色后在显微镜下能看到细胞膜，但是做了几次，就是看不到细胞膜，细胞核可以看到，所有细胞质都染成红色，根本看不到细胞膜，哪位老师能指点下，如何才能把细胞膜清晰的显示出来。

芸(1234567) 11:23:47

相差显微镜行不？

芸(1234567) 11:24:17

你为什么要看细胞膜呢？

前程(12345678) 11:24:51

我要用体式学方法测量细胞3D参数啊

前程(12345678) 11:25:39

我必须要能看到细胞膜，这样才能辨别每个细胞的界限，请问有什么方法？

芸(1234567) 11:28:54

哦，

芸(1234567) 11:29:51

有些细胞 的界限本来是不清楚的

芸(1234567) 11:30:35

也许你可以只测那些辨别的清的细胞

前程(12345678) 11:31:02

我要做小鼠胚胎的石蜡切片

芸(1234567) 11:31:34

材料还是要处理的好，细胞结构容易完整，

前程(12345678) 11:33:02

我看有国外人用的是树脂切片，切得1微米，甲苯胺蓝染色最后可以清晰看到细胞膜的，但是我没有超薄切片机，因此这条路走不通

芸(1234567) 11:33:29

哦，那就是了，这条路不难。

前程(12345678) 11:34:00

但我没这个超薄切片机，它跟一般切片机不一样啊

芸(1234567) 11:34:14

给别人切，花钱呗。

芸(1234567) 11:34:26

树脂包埋的效果好。

前程(12345678) 11:34:38

哦，我想自己做

芸(1234567) 11:35:08

不是所有的东西都非得自己做，特别是别人做过的东西，呵呵。个人观点

前程(12345678) 11:36:44

超薄切片机跟一般切片机什么区别，我的是leica 2235型号的

芸(1234567) 11:38:04

这个问题，我不是很懂，印象中是刀不一样呢？还是切片者的技术水平不一样？我知道半薄切片就非常不好挑片。你搜索一下看。问问资深技术员。

前程(12345678) 11:38:31

是不是只要换下刀片就可以了

芸(1234567) 11:38:51

2微米都很难挑片了，更何况1微米。

芸(1234567) 11:39:10

你查查资料看看。

前程(12345678) 11:39:31

哦，我是杭州的，你是哪的？

芸(1234567) 11:39:39

我是福建的。

前程(12345678) 11:40:41

我做小鼠胚胎切片从50%乙醇脱水有没有问题？

芸(1234567) 11:42:00

我不太懂，我不做动物的，不过，听说蛙卵之类的脆弱的小东西要从30%开始。哦，建议你去浙大附一找个丁伟老师问问，他水平不错的。

前程(12345678) 11:42:32

好的，谢谢

芸(1234567) 11:42:41

你也可以在华夏的技术论坛贴个贴问问。

芸(1234567) 11:42:55

他也来论坛里的。

前程(12345678) 11:43:21

我原先找过个病理科的老师，他帮我设计了个切片方案，但是感觉时间太长了

芸(1234567) 11:43:35

http://www.ipathology.org.cn/forum/forum_list.asp?classcode=110

芸(1234567) 11:43:56

精工出细活，有些事急不得。

芸(1234567) 11:44:34

科研在相当的程度上是对人聪明才智和耐心的考验。

前程(12345678) 11:44:52

50%乙醇----------2h

60%乙醇----------2h

70%乙醇----------2h

80%乙醇----------2h

90%乙醇----------2h

95%乙醇----------2h

95%乙醇----------2h

无水乙醇1----------30min

无水乙醇2----------1h

无水乙醇3----------1h

透明：

二甲苯1------------15分钟

二甲苯2------------30分钟

二甲苯3------------30分钟

浸蜡：

石蜡 1-----------------1h

石蜡 2-----------------4h或过夜    （石蜡熔点是60----62℃，浸蜡温度在65℃左右，不能太高。在烘箱进行较好，烤片必须要60℃ 4小时或者95~100℃烤片20min，展片温度一般控制在42℃左右，不要超过45℃）。

前程(12345678) 11:45:26

这是我的部分步骤，感觉时间太长了，请问能否缩短时间

芸(1234567) 11:46:38

我感觉似乎高浓度酒精长了些，浸蜡第二道也长了些，烤片也可适当短些。

芸(1234567) 11:47:01

浸蜡似乎能低一二度，

芸(1234567) 11:47:36

我对这些只是兴趣，没有深入研究，

前程(12345678) 11:48:00

我现在打算用熔点为56-58度的蜡，我在烘箱内进行，烘箱温度为60度

芸(1234567) 11:48:11

我想小动物的内脏非常脆弱，你这些程序似乎用在人体组织的时间都足足了。

芸(1234567) 11:48:39

也许可行，摸索问题，只能一点点地试验了。

前程(12345678) 11:48:54

我就是感觉时间太漫长了，很想缩短时间

芸(1234567) 11:49:34

烤箱温度可稍高，现在的电烤箱一开门就急速降温

前程(12345678) 11:49:35

那么烤片一般所少度，多长时间？

芸(1234567) 11:50:01

60度1小时致1个半应该可以了

前程(12345678) 11:50:42

那烤箱温度高了，里面蜡液温度高了，对组织没有影响吗？

芸(1234567) 11:50:55

只是稍高一两度问题不大。

芸(1234567) 11:51:17

从前那种水浴烤箱好。

前程(12345678) 11:51:35

那在水浴锅里好吗？

芸(1234567) 11:51:39

你要多参考动物病理的文章。

前程(12345678) 11:51:54

好的

芸(1234567) 11:52:00

感觉还是烤箱好

前程(12345678) 11:53:08

你刚才说我第二道浸蜡长了，那能否缩短至多长时间？

芸(1234567) 11:53:58

总共4 小时浸蜡就足够了，

芸(1234567) 11:54:21

第一道可稍短，可加第三道，这样更精工。

芸(1234567) 11:54:42

第一道混有二甲苯太久不好。

前程(12345678) 11:54:53

那三道浸蜡时间该怎么样？

芸(1234567) 11:54:56

不过，你是手工脱会好些。

芸(1234567) 11:55:28

比如，一道半小时，二道一个半，三道两小时。

前程(12345678) 11:55:37

是的，我每次就1-3个组织，我是在烧杯里浸蜡的

芸(1234567) 11:56:29

过夜可能就太久了。

前程(12345678) 11:57:14

我以前也问过不少医院，每天都有自己一套方案，都不是太一样

芸(1234567) 11:57:50

芸(1234567) 11:57:50

是啊，五花八门，不过，基本思路相似罢了。

前程(12345678) 11:58:46

还有我的染色，经常伊红染的不够好

前程(12345678) 11:59:05

切片脱蜡至水：

二甲苯1-------------------------8 min

二甲苯2-------------------------8 min

无水乙醇------------------------2 min

95%乙醇-------------------------2 min

75%乙醇-------------------------2 min

自来水洗-------------------------没有膜在就可以了，把酒精洗掉就可以了

苏木精浸染----------------------5--10 min   Harris氏苏木素液

自来水洗

1%盐酸乙醇分化---------------数秒          苏木素若染色背景不深，这步可以省略。

自来水洗-------------------------中止分化                                           

50℃温水蓝化-------------------1 min

自来水洗

95%乙醇-------------------------2 min

伊红染色-------------------------3--10秒   沉淀酸化伊红Y乙醇液（水溶性伊红）

自来水洗

脱水--透明--封固：

95%乙醇--------------------- 2秒

无水乙醇-------------------- 5秒

无水乙醇--------------------3~5秒

无水乙醇--------------------1min

二甲苯1---------------------5 min

二甲苯2---------------------5 min

中性树胶封固、晾干（制片流程结束）

芸(1234567) 11:59:14

那是问题了，你又在乎细胞膜。

前程(12345678) 12:00:24

我的伊红经常染的不够红，哪地方出问题了

芸(1234567) 12:00:29

二甲苯后的纯酒精要多加一道

芸(1234567) 12:01:02

伊红时间可稍延长，另外检查配方和药品质量

芸(1234567) 12:01:49

最后几道的透明封固前酒精步骤可稍延长。

前程(12345678) 12:01:56

那伊红可染大概多长时间？

芸(1234567) 12:02:31

不定，看情况，数秒到一两分钟。

芸(1234567) 12:03:09

组织前期制作要好，比如，固定好，否则片子不艳丽

前程(12345678) 12:04:21

前程(12345678) 12:04:21

我用4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液固定的

芸(1234567) 12:05:02

问题就在这里，

前程(12345678) 12:05:12

什么问题？

前程(12345678) 12:05:32

这个固定液不好

芸(1234567) 12:05:47

听说这种片子在染色前你可以在稀醋酸溶液中浸泡数一两分钟再进行染色。

芸(1234567) 12:06:06

这个固定液对免疫标记好，但对HE染色不好。

前程(12345678) 12:06:33

那用HE染色，用什么固定液好呢？

芸(1234567) 12:07:13

我不建议用普通甲醛，因为你的做研究，今后可能要用免疫组化染色，你如果用了普通甲醛恐怕对免疫组化不好。

前程(12345678) 12:07:41

那该用什么固定呀较好

前程(12345678) 12:09:20

我目前只考虑做下HE染色，免疫组化暂时不做，

芸(1234567) 12:10:20

不做免疫组化的话，你只要改用普通的4%甲醛固定就OK了

前程(12345678) 12:11:45

很多人不是用10%的中性甲醛吗？

前程(12345678) 12:12:37

我的最终目标是能看到细胞膜就可以了

芸(1234567) 12:13:26

不是的，所谓10%中性甲醛是一种误称。

芸(1234567) 12:13:43

应该是10%中性福尔马林，

芸(1234567) 12:13:53

它的实际甲醛浓度就是4%

芸(1234567) 12:14:17

甲醛蒸汽的饱和水溶液浓度只有40%

前程(12345678) 12:14:36

那我用10%中性福尔马林固定是不是比4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓液好点？

芸(1234567) 12:14:40

所以，10%的福尔马林就是4%甲醛。

芸(1234567) 12:15:20

是的，加了PBS（磷酸缓冲）后染色出来的片子不艳丽。

前程(12345678) 12:16:00

那你说的固定液配方该是怎么杨的？

芸(1234567) 12:16:05

福尔马林的意思就是甲醛水溶液，不是甲醛本身。甲醛本身常态是气体。

前程(12345678) 12:16:35

加PBS不是防止生成甲酸吗？

ling830(284499457) 12:16:36

固定液分单纯固定液和混合固定液。

1甲醛（formaldehyde）

是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。

10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。

经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。

2 乙醇

无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。

3 中性甲醛液（混合固定液）

甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4 H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。

4 AF液（混合固定液）

95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。

此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。

以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。

芸(1234567) 12:16:56

很简单的，只要把福尔马林配成4%的甲醛水溶液就行了。甚至自来水就行，不用蒸馏水。

ling830(284499457) 12:16:56

都有了

芸(1234567) 12:17:16

就是要有少量甲酸才容易染上伊红

前程(12345678) 12:17:42

这样的啊

芸(1234567) 12:17:44前程(12345678) 12:17:42

这样的啊

芸(1234567) 12:17:44

前程(12345678) 12:18:51

那我的小鼠胚胎用中性甲醛固定2个月后，再做切片，有什么要注意的吗？

芸(1234567) 12:19:16

还固定2个月，怎么好呢，唉，固定太久了哇

前程(12345678) 12:19:39

因为就我一个人做啊，我忙不过来呀

芸(1234567) 12:19:42

那么脆弱的小东西，固定6小时应该都可以了。

芸(1234567) 12:19:58

忙不过来也得讲原则嘛

芸(1234567) 12:20:30

芸(1234567) 12:21:06

芸(1234567) 12:21:06

给830挂个第二作者，他帮你。

前程(12345678) 12:21:51

上次有个医生跟我说，甲醛固定久了，容易产生甲酸，进行脱水之前要用水洗一段时间，是这样吗？

芸(1234567) 12:22:25

那是啊，可是固定太久了，效果就是不好，冲洗虽然好些，还是不如固定恰当的好。

前程(12345678) 12:22:24

哦，没问题

芸(1234567) 12:23:51

你看，我们的对话都差不多是一篇论文那么长了。还是下线吃饭了先吧。

前程(12345678) 12:24:26

那像你刚才说的那样，用中性甲醛固定6小时后，在脱水之前要不要用水洗？

前程(12345678) 12:24:33

好的，谢谢你了

前程(12345678) 12:25:20

830能不能帮我把细胞膜显示出来啊？

芸(1234567) 12:26:13

可稍洗，

前程(12345678) 12:26:31

830能不能帮我把细胞膜显示出来啊？

芸(1234567) 12:26:35

比如洗个个把小时就行

芸(1234567) 12:26:55

 他早去吃午饭了。

前程(12345678) 12:27:12

那等他回来再问他

芸(1234567) 12:27:14

估计你改进之后，细胞膜会好看些的。

前程(12345678) 12:27:35

我以前做的片子根本看不到细胞膜

芸(1234567) 12:27:52

你也可试试用国外那个染色。

芸(1234567) 12:28:19

中秋节他可能要回家了啊。

前程(12345678) 12:28:21

那个就是甲苯胺蓝染色

芸(1234567) 12:28:32

是的，可以试试。

前程(12345678) 12:28:52

前程(12345678) 12:29:08

能做成这样的片子就可以了

前程(12345678) 12:29:15

这是国外人做的

芸(1234567) 12:29:22

哦，黑白照片。

前程(12345678) 12:29:30

是的

芸(1234567) 12:29:36

什么部位的照片

前程(12345678) 12:29:52

大鼠胚胎脑部切片

芸(1234567) 12:30:20

国外的技术很精的，你要看看人家怎么处理组织的。

前程(12345678) 12:30:31

他是用树脂包埋的，1微米切片，甲苯胺蓝染色，超薄切片机做到的

芸(1234567) 12:30:55

此外，你还要看他的固定和脱水过程啊

前程(12345678) 12:31:03

用这个固定液固定的       Karnovsky’s  xative,

芸(1234567) 12:31:16

这片一看就是水平高的，

芸(1234567) 12:31:24

你可以参考他的配方。

前程(12345678) 12:31:28

脱水就是用乙醇固定的

芸(1234567) 12:31:52

关键是浓度和时间，不只是试剂的名称。

前程(12345678) 12:31:54

这个固定液我查了，说是用在免疫电镜上面的

芸(1234567) 12:32:14

要学到细节才行。那叫惟妙惟肖

前程(12345678) 12:32:23

这他没写，只说用上行酒精脱水

芸(1234567) 12:32:38

可以写信咨询的

前程(12345678) 12:32:55

我现在怀疑是不是这个固定液Karnovsky’s  xative,的问题

芸(1234567) 12:34:07

有关系的。你的固定方法我觉得不好，

前程(12345678) 12:34:12

他的固定液配方较简单

(4% 多聚甲醛 和 1% 戊二醛溶解在 0.1 M磷酸盐缓冲液, pH7.4, 4–10摄氏度).

芸(1234567) 12:34:52

哦，可是他不是用HE染色，很多步骤是配套的，要注意。

芸(1234567) 12:35:01

所以还是要惟妙惟肖，

前程(12345678) 12:35:02

他就比我原先的固定液多了个戊二醛

前程(12345678) 12:35:23

他用的就是单染色，甲苯胺蓝

芸(1234567) 12:35:42

你们不一样的地方多了，人家固定多久呢，人家超薄切片呢。

前程(12345678) 12:36:16

这个细节文献里查不到，属于保密吧

芸(1234567) 12:36:56

是啊，有些是不公开的，而有些是省略的，你只有直接问他。

芸(1234567) 12:37:13

或者他只是常规，就不必要交待。

芸(1234567) 12:37:38

试验还有些人为没察觉到但实际存在的微妙之处。

前程(12345678) 12:37:40

超薄切片我切不到1微米，但是应该能切到2-3微米，上次发邮件问了这个国外作者，根本没回

芸(1234567) 12:38:19

这个问题他似乎不必问他，那是纯技术的高度，

前程(12345678) 12:38:31

你觉得这个Karnovsky’s fixative有什么特别之处吗？

芸(1234567) 12:38:46

总有的人能切到那么薄，那是多年的经验，不是初练者能达到的。

前程(12345678) 12:38:58

你觉得这个Karnovsky’s fixative有什么特别之处吗？

芸(1234567) 12:39:03

当然，

芸(1234567) 12:39:42

戊二醛似乎还能用于电镜研究，用PBS似乎就是为了今后研究可能IHC。

前程(12345678) 12:40:36

我在国内查Karnovsky’s fixative时，都说用在免疫电镜方面，但是这个国外作者是用在光镜上的

芸(1234567) 12:41:13

唉，他的样本不单纯用在光镜，国外做事非常讲究全面的，

芸(1234567) 12:41:39

我猜对了吧，就是免疫、电镜两方面兼顾