免疫组化的基本原理
      免疫组化是免疫组织化学技术的简称。它是应用抗原、抗体特异性结合的原理，使用已知的抗体在病理切片上与相应的抗原结合，然后把结合产物应用组织化学的方法显现出来，使之可以在显微镜下观察得以确认。通常使用的显色剂为联苯胺，结合的抗体显示为棕色颗粒，所以把免疫组化成为“棕色革命”

      组成人体细胞分为若干种，如：上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、血细胞等，每种细胞都有其特殊的结构物质，每种细胞都有其特异功能，每种功能又有其物质基础。如：鳞状上皮细胞通过角化物可以防止机体水份的蒸发和外界病原体的侵入，肌肉可以通过肌动蛋白使自己收缩。突触素可以传导神经兴奋，某些器官借以实现其功能的激素受体，载有遗传物质的DNA全段——基因等

          现在人们都可以把这些物质纯净的分离出来，并把它们作为抗原免疫大鼠和家兔，使之产生相应的抗体，人们再把每种抗体分离纯化，就得到我们免疫组化应用的抗体。我们把这些抗体作用于病理切片，然后再通过染色，如果切片上有这种抗体对应的抗原，就会在切片上出现棕色颗粒，如果没有棕色颗粒，就说明没有这种抗体的抗原，在显微镜下就一目了然了

免疫组化标记在妇科肿瘤的应用及其意义
      免疫组化以它的特异性和敏感性，结合组织学上的定位性已成为多种肿瘤病理形态学诊断的新手段。这里需要说明的是虽然目前具有诊断价值的肿瘤标记物有数百种之多，但至今还没有发现人体肿瘤的特异性抗原，也就是说还没有任何一种抗体能100％地确诊一种肿瘤，仍有待于人们追求实现。
免疫组化标记在妇科肿瘤的应用及其意义
      尽管如此，人们正是得到了一些与肿瘤相关的抗原，存在于肿瘤细胞的胞核、胞浆和胞膜上，它的存在或量变可以提高肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生，细胞分化、细胞功能，以有助于肿瘤的诊断，鉴别诊断、分类，判断预后和指导临床治疗。
     目前具有诊断价值的肿瘤标记物虽已有数百种，但在临床病理诊断常用的有50余种，其标记物有以下类型：
肿瘤相关抗原
      这种抗原只存在肿瘤组织中，正常组织内没有或含量甚微。或其为几种类型肿瘤所共有，故又称为肿瘤群体抗原，对判断肿瘤的良、恶性和起源均有一定帮助

CA125  
     对卵巢上皮性肿瘤都有一定的表达，但主要对浆液性肿瘤阳性表达，卵巢粘液性腺癌CA125 不表达。可以用于这两种肿瘤的鉴别诊断。 CA125 对子宫内膜样肿瘤透明细胞癌，未分化癌上皮成份也是阳性表达。（图1）


CEA癌胚抗原   
      广泛存在于各种上皮性肿瘤，大多数卵巢浆液性肿瘤不表达，而卵巢粘液性肿瘤表达在子宫内膜样腺癌，透明细胞癌，勃勒纳氏瘤CEA都有不同程度的表达，在胃肠道恶性肿瘤中CEA也为阳性表达，所以卵巢库肯勃氏瘤CEA也是阳性表达。（图2）


AFP甲胎蛋白   
          是胚胎卵黄囊细胞，胚胎肝细胞和胎儿肠道细胞合成的一种糖蛋白，主要用于肝癌的诊断，在卵巢内胚窦瘤、胚胎性癌，恶性畸胎瘤都为阳性表达
细胞结构抗原
      这种抗原可存在于正常组织和肿瘤组织中，为某些组织细胞群所特有，对判断肿瘤起源有重要意义

CK7:
      主要标记腺上皮和移行上皮。卵巢、肺、乳腺上皮CK7阳性表达。而结肠，前列腺和胃肠道上皮CK7阴性表达。可用于卵巢癌与胃肠道癌的鉴别诊断。（图3）

CK20:
           主要标记胃肠道上皮、尿道上皮。卵巢粘液性囊腺癌CK20为阳性表达。子宫内膜腺癌、宫颈鳞癌、乳腺癌、肺癌和卵巢非粘液性肿瘤CK20均不表达。（图4）


desmin 结蛋白
           为中间丝蛋白之一，分布于正常平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞和 肌上皮细胞及其肿瘤中。结蛋白在良性肌源性肿瘤是强阳性表达，而在平滑肌肉瘤中表达率仅为50％，另外在平滑肌瘤中结蛋白与波形蛋白Vimentin（是表达间叶组织来源的肿瘤，上皮来源肿瘤不含此蛋白，用于癌与肉瘤的鉴别，恶黑与癌的鉴别等）的表达呈反向关系，分化越好结蛋白阳性反应越强，波形蛋白阳性反应弱或阴性；反之，分化越差，结蛋白反应弱或阴性，而波形蛋白反应越强。另外含有肌源成份的癌肉瘤，恶性中胚叶混合瘤，畸胎瘤中也存在结蛋白

S-100  
      是一种可溶性酸性蛋白，主要存在于神经组织、垂体、唾液腺等组织，是神经性肿瘤的主要标记。在恶黑及脂肪肉瘤为阳性表达
SMA 肌动蛋白
          是一种标记平滑肌瘤的蛋白，主要用于诊断平滑肌瘤、血管平滑肌瘤，平滑肌肉瘤以及肌上皮细胞。在乳腺肿瘤中以此抗体检测导管上皮肌上皮细胞阳性与否来判断乳腺肿瘤的良、恶性

      可用于某些生殖细胞来源的肿瘤和妊娠有关的肿瘤的诊断，常用的有：
内分泌激素及其受体抗原
          包括肽类激素和类固醇激素两种，以肽类激素抗原应用较多，常用有胰岛素、高血糖素、胃泌素、生长抑素、降钙素等。
      类固醇激素有雌激素、孕酮、睾酮等。但此类激素在组织切片中保留困难，且在组织内有多种结构类似的激素前体，不仅染色效果不好，且难以正确判断。所以多检测其激素受体。如：ER（雌激素受体）、PR（孕激素受体）（图5、6）

肿瘤中病毒抗原
HBV（乙型肝炎病毒） 主要用于肝炎、肝硬化、肝癌的研究。现在大多数认为HBV感染与肝癌发病有密切关系，具有间接致癌作用。肝癌是HBV感染的结果，而HBV感染是形成肝癌的必要因素
HPV（人乳头状瘤病毒）特别是HPV16、18是宫颈癌主要致病病毒，亦可用于头颈部癌、前列腺癌和食管癌的研究
HIV（人类免疫缺陷病毒）即艾滋病病毒，表达于淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、滤泡树突状细胞和HIV感染的神经胶质细胞，主要用于艾滋病的研究.另外还有HSV（单纯性疱疹病毒等）
作为判断预后的标记抗体
常用的有：
  C-erbB-2
      是一种癌基因蛋白质，存在于细胞膜上，该蛋白可加速细胞的运动，参与细胞浸润和转移调节。在乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胃癌阳性表达提示预后差。特别是乳腺癌阳性表达具有独特的预后价值，阳性表达者复发及转移率高，无瘤生存期及总生存期短。宫颈腺癌C-erbB-2 阳性表达者盆腔淋巴转移率和宫颈深肌层侵犯率高于阴性组。（图7）



P53（肿瘤抑制基因）
          P53蛋白也是现代分子生物学中研究最多的蛋白质之一， P53蛋白除具有细胞生长阻滞作用外，同时还参与细胞DNA的损伤与修复、细胞生长与分化、诱导细胞调亡的过程，目前认为P53是生命科学领域中最重要的蛋白质分子


      P53是肿瘤抑制因子，但由于失活、突变使蛋白结构发生变化，这在许多恶性肿瘤中可以见到P53基因的突变，特别是结肠癌、直肠癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、宫体癌、食道癌、胃癌、肝癌、乳腺癌及膀胱癌尤为常见。另外对骨肉瘤、软组织肉瘤、淋巴瘤及白血病等恶性肿瘤细胞中也可见到。研究证明， P53突变与肿瘤大小正相关，与分化程度、病人的总生存期和无瘤生存期呈负相关。 P53突变肿瘤复发率和死亡率明显高于阳性者。且P53突变与肿瘤血管侵袭呈明显相关
     

      在多种恶性肿瘤中突变性P53蛋白表达水平升高，用免疫组化可以检测到，所以我们仍以P53阳性表达来预测患者的预后、术后易复发等指标。
      P53阳性表达与癌前病变的关系也极为密切，在宫颈和食管非典型增生中均可检测出P53蛋白（图8）


PCNA（增殖细胞核抗原）  
           是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽。 PCNA阳性表达与细胞增殖活性有关，可做为细胞增殖状态的一个重要指标。在恶性肿瘤中PCNA阳性表达提示有肿瘤浸润、转移和临床预后不佳（图9）


  Ki-67
   是一种与细胞增殖有关的核抗原，位于胞核中。Ki-67增殖指数高低即阳性表达与许多肿瘤的分化程度、浸润、转移及预后密切相关，因此被广泛做为各种恶性肿瘤必检项目之一。（图10）


ER、PR  
           是乳腺癌、子宫内膜腺癌、宫颈癌、卵巢癌等必检项目之一。 ER、PR阳性与否与病人术后化疗方案的选择和内分泌治疗以至于肿瘤的复发、转移、预后都密切相关。 ER、PR阳性者，内分泌、化疗治疗效果好，复发、转移率少，缓解期长，生存率高
肿瘤多耐药基因
      在临床肿瘤治疗中，经常有这样的情况：同一种肿瘤，使用同一个治疗方案，或同一个病人，化疗之初和化疗后期，其效果迥异。这种情况决定性原因是肿瘤细胞内是否存在或产生了多耐药性。多耐药性基因编码蛋白可以把化疗药从细胞内泵到细胞外，从而避免了化疗药对细胞的破坏。
肿瘤多耐药基因
      研究表明，癌细胞有六种耐药途径，通俗点说：化疗药物要制服、杀灭癌细胞，而癌细胞有强大对抗办法，使化疗药物奈何不了它，这样，癌细胞仍可肆无忌弹地增生，最后达到危及健康与生命的目的。所以每一位化疗病人在治疗前都应该检查肿瘤的耐药性，如果阳性，可以使用逆转剂，提高肿瘤细胞对化疗物的敏感性

Pg糖蛋白  
            它是多耐药基因产物，作用“药泵”功能，引起癌细胞产生耐药。容易产生耐药抗药药物主要有长春新碱、长春花碱、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、紫杉醇、 VP16等。阳性表达（++）以上有意义，对肿瘤病人选择化疗方案和愈后判断具有重要的临床意义
MRP3  
      多耐药相关蛋白，主要用于非Pg糖蛋白肿瘤细胞系的肿瘤耐药性的研究。容易产生耐药的抗药药物主要有阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、长春新碱、长春花碱、 VP16

我科对常见妇科肿瘤免疫组化检测应用举例
          我们日常工作中根据每位病人，不同肿瘤类型从诊断、鉴别诊断、探讨组织来源、内分泌治疗及化疗前肿瘤多耐药基因及病人的愈后等多方面选择一组免疫组化抗体以达到辅助诊断的目的。我们的原则是选择最少种类的抗体而获得最大量的信息资料帮助诊断。

    子宫内膜腺癌   
         ER、 PR、  Ki-67 、 P53（浆液性乳头状腺癌过表达）、PCNA 、PTEN、MRP3、Pg糖蛋白
         PTEN是一种肿瘤抑制基因，在维持细胞增殖、分化和调亡平衡起着重要作用，该基因在许多肿瘤表现突变和丢失。子宫内膜腺癌的发生一部分是与持续与过多雌激素有关，病人有不排卵、不孕及子宫内膜增生过长的病史。PTEN常为阳性表达，提示预后较好。有些内膜癌患者无雌激素增高，有正常排卵，卵巢功能正常。很多绝经多年的老年妇女，癌周内膜多显萎缩，说明无雌激素影响，这种内膜腺癌发生机制尚不清楚，PTEN的阴性表达提示肿瘤恶性程度高，预后差

子宫平滑肌肉瘤  
       SMA 、 P53、 结蛋白、  波形蛋白、PCNA、 CD10  Ki-67、  MRP3、 Pg糖蛋白
子宫内膜间质肉瘤
        ER、PR、CD10、波形蛋白（+）、desmin结蛋白（7/12）    SMA（ 10/12）有向平滑肌细胞分化现象、P53、  
     Ki-67、  MRP3、 Pg糖蛋白

宫颈浸润性鳞癌  
    CK广谱、  P16、  HPV16、  P53、 Ki-67、  MRP3   Pg糖蛋白。
        P16是一种重要的抑癌基因，当P16基因突变和丢失时细胞增殖失控使细胞无限制增殖而发生肿瘤。在宫颈上皮内瘤变及癌的发生是以P16阳性表达为特征，这与宫颈上皮内瘤变与宫颈癌是由HPV感染所造成细胞不死性有关
宫颈鳞形细胞原位癌及早期浸润
        除以上几项外再加IV型胶原蛋白、 层粘蛋白
      



卵巢浆液性腺癌  
     CA125、 EMA （对内脏腺上皮表达优于角蛋白）
      CEA（－）、P53、 Ki－67、 MRP3、 Pg糖蛋白
卵巢粘液性腺癌  
     CK7（-）、CK20（+）、CEA（+）、EMA（+）、CA125 （-）、S-100（-）、P53、Ki-67、MRP3、
Pg糖蛋白
      


卵巢卵泡膜细胞瘤
  Vimentin(+)( 但无法与纤维瘤区别) 因瘤细胞浆内含类脂质，用脂肪染色可证实
乳腺浸润性癌
    ER、PR、SMA、P63、E-ca、P53、Ki-67、C-erbB-2、  MRP3、Pg-糖蛋白
恶黑
     S-100，HMB-45，NSE
  

      免疫组化染色是通过一系列环节及过程。包括组织的固定，脱水，包埋，切片，各种抗体合理的稀释度，孵育时间及温度，各种有关溶液的浓度和PH值等等，使抗体抗原更好保存并有效地结合，再通过显色液显现出来，最后用苏木素衬染，每一步骤和环节都必须认真处理，一步差错全部失败。
      常用的方法有S-P法、PAP法，ABC法。目前常用的是S-P法，即链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物法。此法可产生低背景，高放大效果，更加简便敏感和特异。






      在完成免疫酶标记全过程后，对于如何判断标记的结果作出正确的诊断是非常重要的。
      首先需要对本病例的石蜡切片，HE染色的切片有一个诊断意见，再次须掌握切片的主要病变区和细胞形态的特点，因为它是免疫组化标记的“靶细胞”，应根据“靶细胞”标记结果判断其性质。

      在染色过程中，某些组织和细胞，如：红细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，中性粒细胞和退化变性坏死组织也可以出现非特异反应，影响对标记结果的判断。在镜下必须会识别，防止误认为阳性细胞。
      抗原抗体结合后显色，阳性时呈棕色颗粒状。细胞阳性着色可以在细胞浆、细胞膜和细胞核。上皮性，肌源性，神经内分泌，黑色素，内皮细胞和外周神经细胞皆为细胞浆表达。即在细胞浆内出现棕色颗粒。淋巴细胞阳性表达是在细胞膜上，围绕细胞膜出现棕色线状结构。ER，PR阳性表达是棕色颗粒在细胞核内。

肿瘤阳性细胞判断标准：


            免疫组化检测对所有肿瘤的病理诊断和科研方面带来了很大的进步，解决了过去无法解决的问题。但是任何诊断方法都不是十全十美的，都有它的局限性。用单一的免疫组化还无法肯定肿瘤的良恶性。如：HMB-45恶黑是阳性表达，但良性黑色素瘤也是阳性表达。免疫组化不能独立作出判断和诊断，要和其他辅助方法与临床资料综合分析才能得出合理的解释。还不能离开传统的，基本的福尔马林固定，石蜡切片，HE染色的诊断方法，众所公认它仍是最经济，完善，快速的基本病理诊断技术，绝大多数标本都能作出正确的病理诊断。所以我们应该在做好HE的基础上开展免疫组化工作。它只是一种辅助方法，扩大了诊断领域