免疫组织化学中的三个主要技术问题

首都医科大学附属北京友谊医院病理科

周小鸽

我个人体会，目前我国免疫组化方面主要存在三大问题：固定问题、修复问题和阳性对照问题。下面就这三个问题谈谈自己的一点看法，供大家参考。

一、固定问题

1、  问题：我们病理人都知道，做病理切片，组织需要固定。做免疫组化切片，组织也需要固定。有关免疫组化技术、免疫组化质控、免疫组化标准化的文章和书籍，都少不了写组织固定。但是，我们在实践中做得怎样呢？我们是否清楚每个标本的固定情况？是固定不够、固定够了、还是固定过头了？我们是否知道福尔马林的渗透速度？多大组织起码需要固定多长时间？固定时间超过多久就会影响免疫组化结果？

2、  固定不够是当前的主要问题：虽然近来有些话题和文章涉及到固定时间太长对免疫组化的影响[1]。其实，固定时间超过一周，才可能产生一点影响。因此，除了长期固定的解剖标本有可能受到影响外，常规外检工作几乎不会受到固定时间长的影响。而大量事实告诉我们，经常影响到免疫组化染色和诊断的因素是组织固定不够。我们自己的标本，还有很多会诊的标本，由于组织固定不够，造成组织和细胞收缩，看不清细胞的庐山真面目，免疫组化染色不好（图1），难以做出正确判断，还不时见到错误判断而误诊的病例。

图1  左上图显示组织固定不够造成HE和免疫组化染色只有周边着色。右上图和下图显示固定好部分染色理想；深部组织没有被固定，不着色；交界处固定不理想，仅有部分细胞着色。

3、  组织固定不够的原因分析：为什么会有很多标本或病例出现固定不够的情况呢？这涉及很多方面，其一：固定时间不够：10％福尔马林的渗透速度大约是4小时2.7mm，随着时间延长速度会逐渐减慢[2]。也就是说5mm厚的组织，固定时间大约要4小时才够。增加浓度反而会降低渗透速度。这是科学规律。但是，我们会遇到来自于医院领导、临床医生、病人和病人家的压力。他们都希望病理报告出得越快越好，恨不得就像化验室和放射科出报告一样快。因此，有的单位就以行政手段强行要求病理科将病理技术规范中明文规定5个工作日出报告的时间改为3个工作日出报告。这样只有缩短制片程序，包括缩短固定时间。我们也曾有过这样经历。这种违背客观规律的行政命令，会增加病理诊断的风险，埋下误诊的隐患。强制实行3个月后，在我们积极努力下，医院接纳了我们的意见，又回到5个工作日出报告的正确做法上去了。另外，大家可能也有体会，熟人和重要人物（VIP）的诊断出问题的频率很高，其中的原因就是想急于知道病理结果，不顾客观规律，不按照规范程序制片。饭还没有做熟就要吃饭，肯定只能吃夹生饭。其二：固定液浓度不够。很多单位的标本是在手术室就固定上了，固定液是手术室护士或护工配制，多数不规范，往往配制的浓度不够，因为福尔马林浓度高了，刺鼻的味很大，他们会闻着难受，更何况现在全国都在大谈甲醛与致癌有关。其三：固定液用量不够：病理规范中明确写着，固定液的用量是标本体积的5-10倍。我们可以自己看看，我们的标本有多少是达到了这个要求。可能只有内镜活检、骨穿等小标本达到这个标准。其四：大标本或有包膜的组织不切开固定：大标本不切开，里面的组织肯定固定不好，我们可以看看，自己的单位是否做到了将大标本切开固定。淋巴结常常固定不好，细胞收缩，免疫组化染不好，就是没有将淋巴结包膜切开，影响了固定液的渗透。

4、  解决办法：重视固定！！！书上写了很多，但是如果不重视、不落实在具体工作中，就不能解决问题。关键是重视，重视了才能采取各种措施解决固定问题。

二、抗原修复问题

1、  抗原修复不够：对绝大多数抗体来说，不修复肯定不好。抗原修复是免疫组化发展史上一个里程碑。抗原修复将很多以前只能在冰冻组织中应用的抗体能够成功的用于石蜡切片组织。目前我国的主要问题是修复不够，而不是修复过度！中国工作者委员会四年来在全国开展了8次免疫组化质控活动，有数百家单位参加。从总体来看，最突出和最顽固的问题还是修复不够[3]。从我们会诊的病例中也能见到不因少抗原修复不够从而导致免疫组化染色结果不理想的情况，经过重新切片和抗原修复后得到了理想的免疫组化结果。

2、  抗原修复不够的原因：一是温度不够，热修复的温度没有达到100℃。技术人员主要担心，达到100℃修复液沸腾可能会造成组织脱片。二是时间不够，有的技术人员认为切片在修复液里“煮煮”就行了，多数染色不理想的切片修复时间都短于15分钟[3]。

3、  影响抗原修复因素：修复的方法多种多样，修复液也有很多种。但是影响抗原修复关键因素有两个，一个是温度，一个是修复液的pH值。温度至少要达到100℃。时间可根据温度高低来调整。如果是100℃，至少要15min，20min更好。如果是120℃，2-3min即可。pH值对抗原修复有明显影响，如图2所示。实验发现，修复液的pH值对抗原修复的影响分为三类[4，5]：A、B、C。A类抗原在任何pH条件下，修复结果都很好；B类抗原在低和高pH时，修复结果很好，但是在中等pH时，修复效果很差；C类抗原随着pH的增高，修复结果也越来越好。这样，如果实验室只想用一种修复液，又能兼顾三类抗原，就可以选择图中三条曲线相互最靠近的区域（圆圈处）所对应的pH，此处所对应的pH为8-9。因此，总体看来，高pH修复液比低pH修复液更好，覆盖抗原更广泛。现在新出的在核表达的抗原越来越多，其中很多是需要高pH修复液才能达到理想效果。我们多年来一直使用的是EGTA/pH8-9的修复液，效果很好。我们只有四种抗原（CD68、S-100、Vimentin和lysozyme）不用这种修复液而是酶消化。

图2 修复液pH值与抗原修复效果。

三、阳性对照问题

1、  不设阳性对照的原因：目前在我国不设立阳性对照是普遍存在的现象，其主要原因是不愿意增加工作量和增加免疫组化成本。其次是科室负责人不重视设立阳性对照，对设立阳性对照的意义认识不深刻。

2、  设立阳性对照的意义：免疫组化的影响因素很多，都解决起来也很难。但是，有一个简单的解决办法，几乎可以将这些头痛问题都解决，这就是：设立阳性对照。每次染色、每种抗体染色都设立阳性和阴性对照（图3），这样，阳性对照染色成功，说明抗体和技术过程没有问题；反之，肯定有问题，需要找原因，进行改进。设立阳性对照有五个好处：对技术员来说，可以知道自己的染色是不是成功了，能做到心中有数，对自己技术也是一次检验和鉴定；对医生来说，可以知道这张切片染色是否合格，是否可以进行判断，可以将不合格的切片去掉，避免由此产生误判；对患者和临床医生来说，可以得到一个更准确的诊断，更利于治疗；还可以减少医生和技术员之间因切片染色结果看法不同引发的矛盾；也可以为因免疫组化引发的医患纠纷提供物证。建立阳性对照，是保证免疫组化质量的一个重要环节，是质控的一项重要措施，是发展的必然趋势。虽然成本会增加，工作量会增大，但是与做出一张不合格的切片和一个错误诊断造成的损失相比，就微不足道了。

3、  阳性对照的种类：阳性对照组织可用：（1）、阑尾：阑尾是比较简单的阳性对照，阑尾含有很多种组织和细胞，可以作为多种抗原的对照。2、多组织切片：可根据需要收集各种各样的组织，切成丝，包埋在一起，然后连续切片备用[6]。3、组织芯片：类似于多组织切片，只是用芯片仪将各种各样的组织排列在一起进行连续切片（图3）。

图3左侧为组组织芯片阳性对照，右侧为测试组织。

参考文献：

1、郑杰。免疫组化——病理诊断的重要的检查。继续医学教育，2006，20（27），60-64。

2、龚志锦，詹容洲。病理组织制片和染色技术。上海科学技术出版社，1994年，第1版，第5页。

3、周小鸽。全国性免疫组织化学质量控制活动介绍及总结。临床与实验病理学杂志，2007，23（4）：510-511。

4、Shi SR,Imam SA,Young L, et al. Antigen Retrieval Immunohistochemistry Under the Influence of pH Using Monoclonal Antibodies. J Histochem cytochem. 1995 ，43(2): 193-201

5、    王小亚，崔全才。免疫组化标准化及质量控制。//吴秉铨，刘彦仿。免疫组织化学病理诊断。第一版，北京科学技术出版社，2007：46-61。

6、    Chan JK, Wong CS, Ku WT, Kwan MY. Reflections on the use of controls in immunohistochemistry and proposal for application of a multitissue spring-roll control block. Ann Diagn Pathol. 2000，4: 329-336.

名称：图1
描述：图1

名称：图2
描述：图2

名称：图3
描述：图3

谢谢!!!

谢谢周老师！

受益

非常支持周教授的观点!就目前病理科而言,和前十年比较有了很大的区别.现在可以看出医院已经对病理科的重视,但是工作还需要继续,更需要象周教授这样关心病理\支持病理\发展病理的学士一起添砖加瓦.把病理的水平(无论是在技术还是诊断上)更上一层楼!

 非常欣赏周教授的观点！

免疫组化的运用越来越广泛和普及，严格标准化操作的问题日益突出。

但愿全体同行能一起重视和落实工作实践，那么我们的专业会越来越受权威。

真抓实干，严格贯彻执行方可！

 非常有针对性，感谢周教授。临床诊断的所有实验方法中免疫组化是为数不多的，而影响因子较多的方法学之一，标本特别，前处理繁杂，免疫学反应步骤又多。要想真正有助于病理诊断，病理科主任必须要真抓实干，医生要懂技术关键，技术员要有高度的责任心并努力提高自己的技术水平，严格按规范执行，不能想当然，随意简化。如果按周教授的观点严格执行，不愁染不出稳定的高质量的片子。当然，增加工作量是肯定的。