2023-03-15 泰立瑞病理 由于多重技术的快速发展，我们需要分析和解释的图像数据越来越复杂。这个系列，我们将回答研究人员或病理医生在建立多重免疫荧光/免疫组织化学（mIF/IHC）或其他多通道图像分析工作流程起始阶段的常见问题（FAQ）。我们提供实现高效和可重复的mIF/IHC分析的一般指南，主要适用于从3–5μm福尔马林固定组织切片的多重染色（多达8个标记）获得的mIF/IHC数据。 下面的FAQ概述了与mIF/IHC图像分析相关的话题，从分析流程到软件问题。精心设计的图像分析流程将为用户提供丰富的、基于组织的生物信息。 1. 多重免疫荧光图像分析的基本步骤是什么？ 多重免疫荧光图像分析通常分为四个关键步骤： 1）组织识别和分割； 2）细胞分割； 3）细胞分类和分类器的验证； 4）测量输出和数据解释。 有时可能需要额外的步骤，如组织类型分割；在其他情况下，某些步骤（例如基于像素的细胞分割）可能是不必要的。 2.图像分析需要多长时间？ 将根据图像的复杂性和数量而有所不同。在很大程度上取决于要分析的切片数量和大小，包括文件大小和像素数。一个视野可能需要几秒钟来进行细胞检测和分类，而一张包含30个通道的全切片图像可能需要数小时来处理组织识别分割、从基质中分割肿瘤及最终分割细胞。此外，图像托管的地方可能很重要，通过网络或在云上处理图像有助于缓解数据存储问题，但需要传输可能数TB的图像数据。 3.我们应该分析每张组织切片的图像吗？ 要分析的图像数量取决于项目需求。例如，并非所有图像都需要细胞密度分析。考虑到所分析的组织的异质性，分析往往聚焦于生物标记物高表达的区域即“热点”，“热点”分析已用于对按风险大小对患者进行分层⑴⑵。然而，当需要选择图像进行分析时，避免依赖于操作人员的采样偏差至关重要⑶。更复杂空间特征的检测和细胞间相互作用的测量往往需要对整个切片进行分析。 4.哪些图像分析步骤可以自动化？哪些步骤可以分批进行？ 大多数步骤最终都可以自动化，因为前面的手工工作该做的都已经做了。为细胞分类器创建验证集和测试集允许用户测试各种变量和阈值，但一次只能创建一种细胞的。 应始终小心对待图像分析的批处理，因为不同设置下的不同仪器不会产生完全相同的数据，即使使用完全相同的标本。理想情况下，在充分的培训和参数调整的前提下，所有步骤最终都可以一次处理一批，但必须有防护措施必须到位：防止灯泡熄灭、光学元件漂移和抗体改变。每批使用单独的组织（标准块）或细胞对照玻片有助于识别潜在问题 。 5.图像分析产生能得到什么检测结果？ 最常见的指标是分割组织内的细胞密度（例如，每个癌巢或每平方毫米的CD3+细胞数）、细胞百分比（例如，CD3+CD8+细胞占CD3+的百分比）和最近邻测量值（例如，从CD3+细胞到最近癌细胞的平均微米数）。 多重IF/IHC识别和定位组织内复杂细胞表型的能力使我们能够更好地从空间、位置等角度理解和描述组织微环境中的细胞生物学。单个细胞对象可以根据用户定义的细胞表型分类和单个细胞在图像中唯一的X-Y坐标位置来表征。然后，可以测量图像中具有某种特征的所有细胞的空间特征和细胞间相互作用。这些测量可能包括热点、到其他细胞类型的距离、到组织标注（肿瘤边缘）的距离以及细胞的微环境分析（④⑤⑥）。 6.我的实验室没有生物信息技术人员。这会限制或影响我们分析mIF/IHC数据的能力吗？ 一点都不影响！许多软件都是用户友好的、易于使用，生成的数据集可以在简单的电子表格中处理。尽管从长远来看，通过专业信息技术人员编写脚本和处理复杂的数据，灵活性和效率都能得到提升，但建立mIF/IHC能力并不需要生物信息学技术人员。 Image.sc forum等论坛提供了业内人士提问、交流的地方。 7.什么样的新员工适合图像分析这项工作？ 寻找那些喜欢使用计算机和网络的人，他们往往有很好的解决问题和排除故障的能力，天性就喜欢在互联网搜索、找答案。编写脚本和直观地解释原始数据的能力也非常重要。团队合作精神是必不可少的，因为大多数图像分析师不是生物学或统计学方面的专家，他们往往需要寻求专家支持以填补知识空白。 8. 需要什么软件来执行图像分析？ 多重IF/IHC图像分析可以使用商业软件（如InForm、HALO、Visiopharm）或开源软件（如QuPath、CellProfiler、ImageJ）。商业软件提供免编程、内置功能和技术支持，但成本很高（通常为20000至100000美元）。通常，开源软件是免费的，能够实现有限的图像分析功能，包括光谱拆解、细胞分割和图像拼接。 一般来说，商业软件提供更直观的分析流程，并能提供完善的培训和支持，这可能会使刚接触图像分析的用户受益（或有助于员工更替）。开源软件提供了更大的灵活性和定制能力，但可能有更陡峭的学习曲线来开发和完善用户的工作流程。使用开源软件实现自定义功能可能需要用户进行额外编程，但开源社区应用程序和其扩展程序往往已经可以满足特定的分析需求。 9.需要什么硬件支持来进行图像分析？ 硬件取决于您经常分析的图像数量和大小以及您使用的软件。mIF/IHC分析软件通常可以在标准台式机或笔记本电脑上运行。16 GB的RAM通常足以进行简单的全切片分析，可能需要32 GB或更多的RAM进行复杂的全切片分析，尤其是在同时运行多个线程或程序的情况下。RAM限制可能是某些软件运行过程的瓶颈，因为像素分类器和更复杂的分析对RAM需求很大。 其他过程，如细胞检测，则不那么繁重。多线程计算（如细胞检测）受益于多核CPU（以及多个CPU）。如果有足够的技术人员，大部分处理可以转移到云计算上。不过，数千兆字节的图像传输仍然很花时间。 10.如果将图像分析交给合作者或专业第三方服务商处理，有问题吗？ 理想情况下，同一实验室执行染色和图像分析，这样出现问题的话往往很快可以得到解决。然而，外部合作专家和专业第三方机构也是获取和分析mIF/IHC数据的可行途径。在与这些合作者接触时，尽量多花些时间详细了解他们的图像分析工作流程。问他们，对于一个特定的生物标记物，细胞亚群是如何被分类为染色阳性的。他们是不是对你认为是真实的东西设定了阈值？要设置阳性染色、阴性染色和背景，问他们分析中包括或排除组织的哪些区域。检查原始分割结果，而不仅仅是总结和选定的局部快照。图像分析流程中可能会出现很多错误，第三方可能不像我们自己那样积极寻找错误，毕竟，我们自己对最终的数据和检测报告负责。 11.我应该在分析图像之前预处理图像还是从原始图像开始？ 答案取决于生成图像的方法。某些数据采集方法在不同通道之间存在严重串扰（crosstalk），往往需要线性拆解去除来自其他通道的污染。其他类型的数据采集，如质谱成像细胞仪（imaging mass cytometry），可以显示密切相关同位素之间的串扰，不需要对分离良好的通道进行处理。建议进行一些手动质量控制；并非所有样品都能在染色和封片过程中保持完整和不丢损。将多个图像拼接到一个文件中常常可以实现更复杂的空间分析和更好的可视化。 12.我们应该警惕图像中的哪些危险信号？ 清楚地了解染色是如何进行和图像如何生成对于高质量的图像分析至关重要。光谱拆解不好可能导致从一个通道到另一个通道的荧光污染，从而导致误报信号。荧光强度或背景水平的批次或玻片变化都可能导致需要重新染色、重新成像或需要玻片特定的图像分析策略。要注意的染色问题包括非特异性染色和非优化染色顺序，这些染色顺序会导致抗原可用性的“伞效应”不可用。最后，在流程早期排除质量差的组织样本或质区域将使其后的图像分析更准确。 13.如何检查图像分析的质量？ mIF/IHC成像的质量控制（QC）对于确保报告准确至关重要。成功的多重IF/IHC QC应逐一解决组织学制片、染色、成像以及分析前阶段等病理学和免疫学等各方面的技术问题。QC的某些方面可以通过图像分析软件进行，而其他则需要人工观察。简单地说，褶皱、撕裂、组织干燥区域和大体固定伪影应标记出来并从分析中排除（手动或使用像素分类器）。饱和度（由于染色或成像）、离焦区域、一个标记物被共定位标记物的严重覆盖、光谱通道之间的相互渗漏和清晰的染色梯度应都能通过重新成像或将其排除掉来改善。最后，意外的染色模式、标记物定位和多标记物表型（不应在同一细胞中共定位的标记物）可能会使单个玻片或整个批次都不合格。 阴性对照在每个感兴趣的通道中应仅包含自荧光或非特异性信号。阳性对照，（每次运行结果都应一直有可重复性和一致性），应与前几批的相同阳性对照进行比较，以验证在每个通道中观察到的峰值、平均和最小强度具有可比性。 14.如何处理批次变化？ 应仔细、认真地建立图像处理流程，以使其具有高度的重复性。使用允许无偏量化的工具（例如直方图和测量图）。使用内部对照（例如扁桃体染色或其他组织特异性对照组织染色）作为指南。mIF/IHC中常见的技术导致的差异往往源于组织质量差、染色过程不一致和图像采集不稳定。如果在图像分析之前无法缓解这些问题，则使用z评分进行数据标准化可能是一个解决方案。否则，您可能需要对每个批次设定其特定的阈值和细胞分类器。 15.如何处理患者内变异？ 组织微环境通常是异质的，因此同时分析多个感兴趣区域（ROI）至关重要。将组织分割为肿瘤细胞和基质等区域在空间上解析数据特征。随机选择的ROI之间的良好一致性将充分支持使用聚合汇总值（例如，每个患者的平均细胞密度）。无论组织切片、或整个切片组织或组织微阵列核的大小如何，微环境结构中的异质性不可避免地存在并且是可以容忍的，我们的目标是识别具有强大临床适用性的空间免疫生物标记物。 16.我的数据结果非常复杂，有几十个标记。如何解读结果？ 降低项目复杂性的最简单方法是使用几十个标记进行初步试点研究，并选择研究所需的最简单、最有效的组合。与免疫学家或病理学家讨论标志物panel的成员，并根据无偏降维方法（如检测到的复杂表型的主成分分析）做出决策。 此外，机器学习分类器和/或无监督聚类（t-SNE/UMAP）通常可以识别复杂的细胞表型。要有思想准备有些细胞不适合预定的表型！用户必须仔细考虑如何处理和验证这些已识别的细胞类型。为此，请仔细检查细胞分割和表型的准确性，并确保它们最适合您的目标（例如，容易识别淋巴结中密集T细胞的方法可能无法识别肿瘤组织中的大巨噬细胞）。 17. mIF/IHC中的潜在表型和空间指标很多，如何只报告最有用的数据？ mIF/IHC研究中表型分析是预先确定的研究问题的核心，理论假说应推动mIF/IHC设计。这种方法防止由于多次比较、调整而造成的无法进行统计分析的困境。使用与特定患者或组织特征相关的AI表型分析进行二次探索性分析对于发现新表型非常重要⑺。变量选择（例如，L1正则化）或缩减（例如，主成分分析）方法可用于将表型或距离子集化，并具有潜在的临床价值⑻⑼。 18.在发表论文时需要给出多少图像分析流程方面的信息？ 自动化的完整脚本都应包含在补充数据中。除特殊情况外，还应提供分析的代表性典型图像。目前有越来越多的软件方便地支持做这些事情（做总结报告），这也应该是选择图像分析软件时应考虑的因素之一。一些商业软件这方面相当不友好，从而减少任何人复制或引用您的工作的机会。 19.我在哪里可以找到更多信息来学习图像分析？ 商业软件通常包括充分支持和培训来帮助建立业务。本行业相关专业软件网站、在线课程和讲座是往往让您知道某软件或决定mIF/IHC是否适合您的项目。在线论坛，如 image.sc开源项目是非常好的资源。然而，它们的好处往往需要您花许多时间来学习和思考才能得到。关于多重成像的一些优秀文献综述也是很好的起点⑽⑾⑿。 20.推荐的在线资源 培训视频 https://www.youtube.com/playlist?list=PL5ESQNfM5lc7SAMstEu082ivW4BDMvd0U https://www.youtube.com/c/NEUBIAS/videos?view=0&sort=dd&shelf_id=0 免费图像分析免费电子书 https://www.springer.com/gp/book/9783030223854 指南和工具 https://www.nature.com/articles/s41592-021-01156-w https://www.imagescientist.com/image-analysis#qupath 再现性 https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2020105889 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33785609/ 数据托管 https://www.nature.com/articles/d41586-020-00594-4 https://immunoatlas.org/pub 目前基于荧光标记的多重荧光组织免疫mIF/mIHC是探测肿瘤微环境应用最广泛的技术，泰*瑞信息专注于mIF/mIHC的相关技术，致力于将免疫染色（mIF/mIHC）、荧光图像采集和分析的自动化和智能化，研发用于mIF/mIHC的全自动免疫组化染色机（TR-Stainer）（图三）和荧光全切片扫描仪（图二），其中TR-sWSI-5F荧光扫描仪是一款轻量入门级产品，具备快速5色扫描功能（蓝色DAPI、绿色FITC、黄色TRITC、红色Cy5、近红外Cy7），满足目前免疫荧光组化的绝大多数临床需求。而TR-sWSI-MF（定制化） 的多光谱荧光扫描仪可以将多达15种颜色和自体荧光彼此得到很好的分离，从而使用户信心百倍地专注于量化真正发生的生物学相互作用，能够在整个切片上同时观察和测量组织的细胞，包括多种细胞表型。 图二：荧光扫描仪（TR-sWSI-5F） 图三：全自动免疫组化染色机（TR-Stainer） 参考文献 ① F Pagès et al., Lancet, 391, 2128 (2018). PMID: 29754777. ② E Gudlaugsson et al., Histopathology, 61, 1134 (2012). PMID: 22963617. ③S Berry et al., Science, 372, eaba2609 (2021). PMID: 34112666. ④ CM Schürch et al., Cell, 182, 1341 (2020). PMID: 32763154. ⑥A Rasmusson et al., Am J Pathol, 190, 1309 (2020). PMID: 32194048. ⑥C Gong et al., Front Oncol, 8, 649 (2019). PMID: 30666298. ⑦MC Lau et al., (2020). Available at: https://bit.ly/3nUnFD4. ⑧S Barua et al., Lung Cancer, 117, 73 (2018). PMID: 29409671. ⑨ JL Carstens et al., Nat Commun, 8, 15095 (2017). PMID: 28447602. ⑩ WCC Tan et al., Cancer Commun (Lond), 40, 135 (2020). PMID: 32301585. ⑪TZ Tien et al., Histopathology, 79, 139 (2021). PMID: 33400265. ⑫ A Viratham Pulsawatdi et al., Mol Oncol, 14, 2384 (2020). PMID: 32671911. 声明：本文观点仅代表作者本人立场。