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- 免疫组化三步法背景深
免疫组化三步法背景深
我们免疫组化用的是三步法，背景总是有点深，用的SP试剂盒。我们的步骤是下面，望各位老师给看看有没问题。 1 ）、石蜡切片70度烤箱1个小时脱蜡至水。PBS 浸泡 5 分钟 。
（ 2） 高压热修复，切片放入高压锅，气阀喷气后3分钟，把锅放入冷水中直到冷却
（ 3 ）、PBS 冲洗， 3分钟 x3 次。 3%H 2 O 2 室温孵育10 分钟。
（ 4 ）、 PBS 冲洗， 3分钟 x3 次。5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 15分钟，倾去血清，不洗。滴加 一抗 工作液，室温孵育30分钟后 4 ℃ 过夜。
（ 2） 高压热修复，切片放入高压锅，气阀喷气后3分钟，把锅放入冷水中直到冷却
（ 3 ）、PBS 冲洗， 3分钟 x3 次。 3%H 2 O 2 室温孵育10 分钟。
（ 4 ）、 PBS 冲洗， 3分钟 x3 次。5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 15分钟，倾去血清，不洗。滴加 一抗 工作液，室温孵育30分钟后 4 ℃ 过夜。
（ 5 ）、切片冰箱取出后室温放置30分钟， PBS 冲洗， 3 分钟 x3 次。
（ 6 ）、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 室温 孵育 15 分钟。
（ 7 ）、 PBS 冲洗， 3 分钟 x3 次。
（ 8 ）、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 室温孵育 15分钟。
（ 9 ）、 PBS 冲洗， 3 分钟 x3 次。
（ 10 ）、DAB显色剂显色 2 分钟
（ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片
是不是第2步修复的不对，我看丁老师书上说水开后放入切片，我们是直接放入然后加热，水开后计时。
（ 6 ）、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 室温 孵育 15 分钟。
（ 7 ）、 PBS 冲洗， 3 分钟 x3 次。
（ 8 ）、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 室温孵育 15分钟。
（ 9 ）、 PBS 冲洗， 3 分钟 x3 次。
（ 10 ）、DAB显色剂显色 2 分钟
（ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片
是不是第2步修复的不对，我看丁老师书上说水开后放入切片，我们是直接放入然后加热，水开后计时。
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×参考诊断
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xkj2797xkj 离线
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修复不止是高压修复，有的需胰酶、胃酶、EDTA等等，看抗体需要何种修复方法，不是所有抗体都是高压修复，有的抗体无需进行修复。采用正确的修复方法对免疫组化染色很重要，当然，这些都是基于组织固定好、脱水好的情况下。
如果使用HRP检查系统，建议最好在一抗前加卵白素-生物素加以封闭内源性生物素，以防更多的假阳性发生。建议更换为非生物素型酶聚合物检测系统。
背景深的原因很多，要逐一查找原因，比如：一抗浓度过高、DAB浓度过高、抗体孵育温度过高 或过长，抗体质量、PBS冲洗不干净等等诸多原因。
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guoshan: 谢谢您，我会好好找找原因。我现在用的高压修复方法：（直接放入然后加热，水开后计时）用改动吗，一抗要求高压修复2016-04-18 10:16
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xkj2797xkj: 修复液沸腾后放入切片，盖起盖子，冒气后2min。2016-04-22 21:30 -
xkj2797xkj: 修复液沸腾后放入切片，盖起盖子，扣上压力阀，冒气后2min结束。2016-04-22 21:31
（本观点纯属本人意见！仅供参考！本人微信:13759416387）
