提高冷冻切片制片质量方法大合集

冷冻切片作为现代病理诊断的一项重要技术，主要用于临床手术中的病理诊断，它因在第一时间为手术中的方案和手术范围的选择提供准确的参考意见，越来越受到临床的欢迎。随着临床手术数量的不断增加和临床疾病的复杂化，对病理诊断的准确性要求越来越高。只有高质量的冷冻切片才能有高准确的病理诊断，这就要求病理技术员不仅要有高度的责任心，还要有熟练的技术，用最短的时间制出优质的冷冻切片。

一、一般切片

二次脱水法，减少组织细胞的变形，力争让冷冻切片更接近石蜡切片的组织结构，保证冰冻诊断的及时准确，更好地服务于临床。

1、减少造成组织产生冰晶的各种因素，包括规范的组织取材、设置不同组织的冷冻条件、速冷、选择最佳时机切片等；

2、组织切片后立即固定，使用利于染色的混合固定液，（95％乙醇85ml,4％甲醛10ml,冰醋酸5ml）。这种混合固定液对组织细胞有较强穿透力，可使细胞内的蛋白质沉淀并防止组织细胞过度收缩，具有固定速度快、渗透力强、HE染色鲜艳、组织结构清晰等特点。

3、改变染色操作流程，切片染色前进行前期快速脱水处理，脱掉组织内多余水分，减少细胞的变形；

4、染色后进行彻底地脱水、透明，增加组织结构清晰度；

5、使用新鲜染液及试剂，缩短制片时间，使染色股色鲜艳、对比鲜明。

二、妇科标本冷冻切片的常见问题及处理方法

术中冷冻切片快速病理诊断在妇科肿瘤手术中应用越来越广泛，好的妇科冷冻切片需从取材到制片的每一个环节均要重视。

1、取材
标本离体后送检时要保持完整、新鲜，取材过程中需保持器械干燥、刀刃锋利、组织块切面平整。卵巢囊壁样组织冷冻切片时易卷曲、折叠，取材时一般将囊壁样组织切成长条后卷曲成团，保持竖埋状态，利于组织全层切片完整。子宫颈等Leep手术标本，取材时必须辨别黏膜面，每块组织均带内、外及基底切缘,组织呈竖立冻结。子宫肌瘤、卵泡膜细胞瘤等含纤维成分较多，组织质地硬、韧,取材时应切成正方形或长方形。

2、速冻时的最佳切片温度　
组织块迅速置于液氮罐中速冻，可以减少冰晶形成。冷冻时间与冷冻机箱温度、冷冻头温度、组织类型、厚度及大小等因素有关。在冷冻过程中，肉眼观察组织和包埋剂表面呈胶冻状时，及时固定组织托并调整角度按快速键迅速修切。因为组织冷冻是由表及里，当组织表面呈胶冻状时，将其修切去，里面的组织也正好符合切片的最佳时机。因为最佳的切片温度（18- -25℃）约12 s。超过12 s，切片温度升高组织表面水份溢出，组织变软，产生气泡，易发生卷片、粘片、贴不成片。

3、组织固定　
切片完成后应立即置于固定液中固定，勿使切片在空气中干燥，造成细胞核迅速退变、细胞着色力下降，染色后细胞核模糊不清，有如毛玻璃样，严重影响病理诊断。采用甲醇(无水)溶液常温固定 10-15 s，固定效果即快又好。甲醇(无水)溶液每天更换1次,保证固定液的浓度 提高固定效果。甲醇(无水)溶液含有一定的毒性，将所用甲醇(无水)溶液置于圆形5片立式染色缸中，每次用毕立即加盖，操作全程在常温下、通风柜中完成。

4、染色和封固　
在冬春季节苏木精染液应预先放入恒温水育箱中(37℃)，秋夏季节在常温下染色1-2 min即可。终止染色、然后水洗1%盐酸乙醇分化温水返蓝(注意水温、水流的控制，防止组织边缘卷曲、皱缩、脱片)。再放入自来水中蓝化约10 s，伊红对比染色（在500ml伊红染色液中加入5 ml冰醋酸，染色更快，不易脱色，颜色更清晰艳丽，与蓝色的细胞核对比突出）。梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。封片过程中胶水量适中，玻片呈45°角轻轻斜放在滴有胶水的组织上使其自动平滑到位，避免胶水溢出。

三、脑组织冷冻切片制片方法 

1、方法

①根据所取组织的大小在组织托上滴加适量的医用耦合剂。 

②将组织块平放于包埋剂上并用冷冻锤轻压组织30 s，使组织迅速达到较低温度以防冰晶的形成，切片机冻头温度控制在14℃-16℃为宜。 

③切片时用力均匀，厚度8um，用常温载玻片粘贴后放入甲醇中固定1min。 

④放入Gill改良苏木精染色1min，水洗后直接用温水(45℃左右)返蓝，伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。整个过程需时5～7 min。

2、在制片过程中应注意以下几个方面 

①脑组织冷冻切片出现冰晶的主要原因是没有迅速将组织冷冻到合适温度。采用冷冻锤轻压组织，使组织块上下两面同时冷冻，达到迅速冷冻组织的目的。而冷冻切片机冻头温度控制在14-16℃较为适宜，过低易造成组织过硬、变脆，影响切片质量；其次，送检标本要避免用生理盐水纱布包裹，取材刀、镊子等不易粘水取材。

②固定是冷冻切片的关键，要选用甲醇作为脑组织冷冻切片的固定液。在以往的脑组织冷冻切片染色中，存在苏木精染色时间过长的现象，多采用温水水浴加热苏木精染液或将苏木精染液放人恒温烤箱等方法；而采用配制Gill苏木精染液时，将硫酸铝钾水溶液适当加温，同时碘酸钠也可增加30％的量，这样配制的苏木精染液较成熟些，适合冷冻切片染色。而苏木精染色后直接用温水返蓝，不用盐酸乙醇分化，既节省时间，也避免了因分化控制不好而引起染色出现问题，同时直接用温水返蓝后的细胞核更蓝，染色质清晰、核浆鲜明。

总之，要快速制出1张优质的冷冻切片，制片时迅速骤冷速冻是制作高质量冷冻切片的关键，组织冷冻度的选择是优良冷冻切片制作的保障。