楼主 发表于 2015-08-23 22:15|举报|关注(0)

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   常规免疫组化初筛ALK阳性非小细胞肺癌专家共识已经发表了好长时间，今天，才认真地去看了一遍。看完后，深感内疚，在抗原修复一节中，出现了一个致命的错误：（专家组对国内外研究文献和国内常用修复方法进行讨论，建议使用煮沸热修复方法，具体可以采用如下方法之一对抗原进行修复：①0.01mol/L柠檬酸缓冲液（PH6.0），修复10分钟；②EDTA缓冲液（PH8.0）修复5分钟；③EDTA缓冲液（PH9.0）修复3分钟）。在初稿时，有关抗原修复写的是用高温高压处理，在讨论时也没有对修复方法和时间提出疑义，但在定稿时却改成了煮沸处理。虽然煮沸方法的确适合高pH值的抗原修复液，但共识写的抗原修复时间都是按照高温高压设置的，如果采用煮沸方法，修复时间必须延长5-10倍左右，具体时间还需要认证(个人建议0.01mol/L柠檬酸缓冲液PH6.0，高温高压修复10分钟；EDTA缓冲液PH9.0煮沸修复30分钟；EDTA高温高压细胞核会碎裂，可用DGTA，细胞核会好一点）。如果大家按照此共识去做，就会出现大量的假阴性。而我作为参与此共识讨论唯一的技术专家，没有认真核对，没有查出问题，是我严重失责，有着不可推卸的责任，在此向全国病理工作者表示深深的歉意。同时，我也在想，我们的很多共识，大量的规范和具体工作都是技术员在做，真正在行的是他们，为什么我们在制定方案或共识时，不能让更多的技术专家来参与？如果他们参与了，这样的错误可能就不会出现，规范写的也可能更加完善。

   中国的免疫组化还存在很多的问题，从固定开始到修复液的选择、抗原修复方法、冷却时间、冷却方式、孵育时间、孵育温度、一抗浓度、即用型一抗、不同二抗的敏感度、DAB的强度等等都存在很大的不确定性。虽然，经过了这么多年的努力，我们的HER2检测取得了很大的进步，但这种进步一方面是判读水平的提高，另一方面是机器的大量使用。也就是说，如果还是手工的话，也许我们的免疫组化操作水平并没有很大的提高。为什么机器能够做好，我们手工就做不好？首先这和我们的主导思想有着密切的关系：“我不管你怎么做，只要做出来就行。而且我们大量的工作是定性的，强点弱点、多点少点没有关系！”，这种观点导致了免疫组化操作的随意性，我们病理向来都是由医生主导技术，技术员更多的是盲从，缺少主观能动性，医生说什么技术员就做什么。我们都讨厌外行指挥内行，但在实际工作中却不知不觉总喜欢做这样的事，总觉得别人不行，所以，我们的手工操作方法五花八门，没有一家是完全相同的。那么做出来的结果是不是一定是正确的？我相信大部份是正确的，但肯定有一些做出来是假阳性或假阴性或阴不阴阳不阳。各家医院区别在那里？就是这部份。我们需不需把这些都做对？回答应该是肯定的。那么，我们一直在讲规范，讲SOP文件，是不是只要严格遵守SOP文件做的结果就一定是正确的？或者说阳性对照着色结果就一定是正确的？不一定！否则为什么有的片子阳性对照做出来3+，被检组织做出来是2+或1+，到别的单位那做出来的却是3+？那是因为你的方法一直存在问题，可能是你的阳性对照组织是强阳性，很容易着色，但表达略弱的3+组织就会变成2+或1+，那2+或1+主河能变成1+或0；也可能是应该阳性的没有阳性。反之也一样。这种问题我们日常工作经常会出现，你的SOP文件只能说明你的实验室的重复性，也就是一直保证你在完美地重复错误的操作方法、错误的结果，由于这种错误绝对不是全部的组织，只有少数的，所以这也是免疫组化操作方式方法不被重视或没有发现问题的原因。

    既然机器做出来稳定，我们为什么不研究一下是什么原因，手工染色为什么不能向机器染色方法学习呢？机器染色的可变因素很少，拿HER2来说，罗氏的抗体4B5是稀释液（浓度是固定的），抗原修复液、二抗检测系统是固定的，修复和二抗孵育的温度、时间是固定的，那唯一可变的就是一抗的孵育时间，也就是调整一抗的孵育时间来调整整个实验结果的正确性。而手工染色，一抗的孵育时间往往是固定的，那么为什么我们不可以和机器一样，所有医院的操作流程都相同，就是用不同的一抗浓度去适应整个实验结果的正确性，这样的操作是最简单可行的。这样，全国的免疫组化就有了可比性，出了问题很容易找出原因。但如果是用即用型抗体，那操作起来就比较困难。即用型抗体存在很大的问题，不同的修复方法，不同的抗原修复液，不同的二抗，不同的DAB，不同的孵育时间、温度结果都不尽相同，除机器配套使用的即用型抗体外，手工染色是用一种一抗浓度去适应各种不同敏感度的二抗检测系统和各种不同的实验条件，本身就是非常不科学的。要想有一个稳定正确的结果很困难。因此，建议试剂公司应该根据不同二抗、固定修复方法捆绑生产各种不同浓度的即用型抗体。只有这样，才能使免疫组化规范化变得具有可操作性。
    免疫组化是个复杂的工作，留给我们很多的思考，能不能改变我们的思维，走出中国特色的规范化道路，就看我们的医生和技术员，特别是领导层有没有创造性思想，能不能改变自己。

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本帖最后由 dingwei 于 2015-08-26 07:28:20 编辑

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