循环肿瘤细胞（CTC）常用富集及检测方法总结

 一、CTC分离（富集）

（一）形态学原理

1、过滤法

原理：根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTC

代表技术：滤膜滤法分离上皮源肿瘤细胞（ISET）

方法：将全血经过带小孔8μm的聚碳酸酯膜的过滤，即可除去白细胞富集得到CTC.

特点：细胞完整性好；不受细胞表面标示物表达；可检出循环肿瘤拴子；

局限性：不宜检出小于8μm的肿瘤细胞

2、梯度离心法

原理：根据肿瘤细胞与白细胞密度不同，通过梯度离心分离CTC

方法：（Onquick法）密度梯度离心后，白细胞通过多孔滤膜被滤除，而CTC被富集在介质层中，洗脱后得到CTC

特点：可分离CK阳性和阴性细胞

局限性：

    CTC迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞层而丢失

    CTC微栓子可能沉入红细胞层而丢失

    与肿瘤细胞特性、离心时间和温度等有关

    用血量多15-30ml

（二）抗原抗体原理

1、阳性捕获法：免疫磁性分离

原理：采用抗EpCAM 结合免疫磁珠捕获EpCAM阳性CTC

特点：适用于EpCAM或CK阳性CTC：乳腺癌，结直肠癌和前列腺癌

局限性：

   不适用于EpCAM或CK阴性CTC：黑色素瘤，部分膀胱癌

   无法获取全部特征的CTC，例如EMT特征

2、阳性捕获法：芯片法

原理：芯片的表层排布了 78,000 个包被抗 EpCAM抗体的微位点，血液样本流经芯片时，抗体与肿瘤细胞结合粘附在芯片上

特点：适用于EpCAM或CK阳性CTC

局限性：无法获取全部特征的CTC，例如EMT特征

3、阴性富集法：（免疫磁性分离）

原理：利用CD45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用下去除白细胞，CTC被富集沉淀

特点：可以富集全部特征的CTC，例如 EpCAM阴性、CK阴性、EMT特征

二、鉴定

（一）核酸检测

RT-PCR

优势：检测灵敏度很高

不足：RNA易降解；易污染；易假阳性；无法观察细胞形态

（二）细胞鉴别

1、免疫细胞化学

原理：利用CD45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用下去除白细胞，CTC被富集沉淀

特点：可以富集全部特征的CTC，例如 EpCAM阴性、CK阴性、EMT特征

2、流式细胞术

优势：检测速度快；同时多通道检测

不足：检测灵敏度低；无法观察细胞形态

3、免疫荧光染色(IF)

优势：细胞形态可见；检测灵敏度高；目前最常用；检测速度快

不足：细胞形态多样，抗原表达异质性，存在判断主观差异性

4、荧光原位杂交(FISH)

优势：分子检测水平；稳定性高；灵敏度高；特异性高；成熟的临床应用

不足：较短的探针杂交效率低；易受淋巴细胞等因素的干扰