关于DNA制片、染色及细胞筛选部分问题简单答疑

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楼主发表于 2013-05-23 09:55|举报|关注(1)
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关于DNA制片、染色及细胞筛选部分问题简单答疑（转）

1、批量IOD值低问题出在哪？---------- ①所有染色过程及配制DNA染液时的温度应控制在25度左右（避免阳光照晒致局部温度过高或空调正下方吹风局部温度低）；②配DNA染液搅拌旋涡高度应为2CM左右，时长可接近1.5小时（磁力搅拌器调到近最大位置，不要打开加热开关）；③确定5N盐酸是否因为久置挥发或重复使用超过3次及以上而未达到应有浓度（不宜冰箱放置后直接用于酸化染色影响酸化温度）；④各步染色时间是否正确；⑤是否为机器因素所致（空白处CV是否小于2，大于2说明光路存在问题，应注意扫描光路调整；扫描前先扫描质控片进行评估）。⑥其它：如标本不合格（常温久置超过2周）；操作不当（BS液与5N盐酸混一起了而不知情）；5N盐酸、BS液、DNA染液配备不当（特别注意配DNA染液时不要忘了加5N盐酸或搅拌籽,蒸馏水水温不宜过低影响溶解最好温箱中长期备用蒸馏水）等。⑦镜头污染，排除方法是找过去IOD好的片子再次扫描进行对比，差异大说明有可能是镜头受到了玻片上多余的中性树胶污染，中性树胶易溶于二甲苯，用擦镜纸沾上二甲苯试擦即可。
2、同批次标本中少量病例IOD值低（偏峰或出现假阳性）为什么？ ----------①微生物感染特别是滴虫感染、细菌性阴道病，部分患者刷取到的大多数宫颈上皮细胞核发生退变，其DNA片段丢失， “标准化”异常，导致偏峰现象，出现假阳性;②个别标本取材质量不合格（取材不到位或位置太过表浅,细胞核缺乏激素或营养支持已发生退变，这样的取材往往细胞数量不多）;③重新制片时间（取隔天或几天前敞开的剩余标本，由于固定成分挥发，细胞核DNA因固定不好而丢失）；④常温超过2周的标本。
3、细胞数少，为什么？---------- ①医生取材不当（刷取细胞时圈数少于3圈，或力度太轻，或位置不当）；②病人在取材前2天内进行了阴道冲洗治疗、激素药物治疗，取材时使用润滑剂等；③制片离心前未混匀标本或制片时加样过少或太过稀释；④染色或水洗过程中细胞丢失，称为掉片；⑤炎症重或制片太厚细胞核多数重叠机器无法识别；⑥粘液成分较多，染色过程中粘液成分与细胞成块掉落。
4、为什么会掉片(细胞掉入溶液或水中)？------------ ①干燥过度（特别是用吹风机高温吹干或烤干所致）；②未充分干燥；③冲洗不当（水流过大或对着细胞位置冲洗或冲洗次数多）；④制片太厚；⑤血液成分过多；⑥凝胶样粘液成分较多；⑦细胞粘附性低(有些固定液的影响)。
5、 IOD值过高，为什么？（非特异性着色）----------- ①水中浸泡时间不够15分钟或漂洗水温过低；②染色温度过高；③冲洗效果未达到；
6、为什么会出现非特异性着色？（可出现增生样或假阳性）----------- ①常伴有IOD值低，常因为固定不好所致，BS液固定作用是固定DNA及封闭自由醛基；②见第5点。
7、 Mean IOD正常表明染色正常吗？------ 显然不是，mean IOD正常范围并不能代表染色的好坏，只是一个参考标准。如1、染液不过滤染出的制片mean IOD正常，反映的是整体光密度平均值，但是细胞核都有可能附上染液颗粒杂质而使其IOD增高，从而可能导致假阳性，因此染色上可认为是失败的；2、染色时漂洗时间不够或不漂洗，IOD值高，实际上如果正常漂洗IOD可能降至正常范围外的低值，那么实际上其染色是不正常的，结果导致了“正常”的错觉，非特异的着色会使结果不可靠，导致不少的假阳性或可疑病例，这点应特别注意。3、其它原因所致的非特异性着色，如固定不佳等。
8、细胞筛选要点有哪些？注意什么？----------前提是染色各步骤无错误，IOD合格的情况下，细胞筛选会变得相对容易；染色不正常的时候细胞筛选可能会比较难。原则：不要过“删”，避免漏诊；不要保“守”，避免假阳；要恰到好处，科学规范，简便易行。
①了解细胞核染色质可以出现的特点（DNA染色后的细胞核特点）：⑴染色质均匀分布；⑵细颗粒状或粗颗粒状；⑶分布不均；⑷碳墨状；⑸核膜可以不光滑、不规则、畸形或增厚；⑹可出现核沟；
②“核”半边染色深，半边浅或核中间出现多条规则条纹，应去除；
③“核”中间块状深染或多块，无染色质表现特点，应去除；
④双核或多核聚在一起，应酌情去除；
⑤核边缘模糊或一边清晰且核不透光（多为气泡中的细胞核），应去除；
⑥漆黑不透光或有一定透光性但边缘清晰，应做镜下复核；
⑦DI大于2.5，单个不确定的图像，应做镜下复核；
⑧核象“被水浸泡过质感”，深浅部分明显层次感“高低不平”或细胞核与背景很难区分开来，核膜不连续感，多半伴有IOD值低于标准，应去除；不符合发放标准时不宜发报告（强烈推荐）；
⑨圆形或类圆形、玻离状、泡状、空晕样、眼睛样、空白纸打点样“核”，无染色质表现，应去除；
⑩ 核上面大小不等的圆形或椭圆形空格玉米纹理样或斑点空泡状且背景脏乱，应去除；炎细胞、淋巴细胞、上皮细胞或精子细胞核覆盖需酌情去除；
9、粘液成分多怎么办？------ 没有DTT的情况下，可将有粘液的标本管放在涡旋式振荡器上振荡时间要长，至粘液成分打散，管内液体高速转动即可，那样离心后就不会有粘液悬浮的情况，粘液成分在上清部分，细胞被离心至离心管底部。如果未按上述操作，发现离心后的管内是漂浮在液体中的粘液成分，可将标本倒回标本管中后，如上操作后再次离心，或直接把离心管放在涡旋式振荡器上振荡混匀，看不到粘液悬浮后再次离心。标本管中粘液成分过多是因为医生取材时没有用棉签去除粘液所致，常导致标本不合格，有诊断意义的细胞往往少，需建议正确取材。

图1

关于DNA制片、染色及细胞筛选部分问题简单答疑（转）

1、批量IOD值低问题出在哪？---------- ①所有染色过程及配制DNA染液时的温度应控制在25度左右（避免阳光照晒致局部温度过高或空调正下方吹风局部温度低）；②配DNA染液搅拌旋涡高度应为2CM左右，时长可接近1.5小时（磁力搅拌器调到近最大位置，不要打开加热开关）；③确定5N盐酸是否因为久置挥发或重复使用超过3次及以上而未达到应有浓度（不宜冰箱放置后直接用于酸化染色影响酸化温度）；④各步染色时间是否正确；⑤是否为机器因素所致（空白处CV是否小于2，大于2说明光路存在问题，应注意扫描光路调整；扫描前先扫描质控片进行评估）。⑥其它：如标本不合格（常温久置超过2周）；操作不当（BS液与5N盐酸混一起了而不知情）；5N盐酸、BS液、DNA染液配备不当（特别注意配DNA染液时不要忘了加5N盐酸或搅拌籽,蒸馏水水温不宜过低影响溶解最好温箱中长期备用蒸馏水）等。⑦镜头污染，排除方法是找过去IOD好的片子再次扫描进行对比，差异大说明有可能是镜头受到了玻片上多余的中性树胶污染，中性树胶易溶于二甲苯，用擦镜纸沾上二甲苯试擦即可。
2、同批次标本中少量病例IOD值低（偏峰或出现假阳性）为什么？ ----------①微生物感染特别是滴虫感染、细菌性阴道病，部分患者刷取到的大多数宫颈上皮细胞核发生退变，其DNA片段丢失， “标准化”异常，导致偏峰现象，出现假阳性;②个别标本取材质量不合格（取材不到位或位置太过表浅,细胞核缺乏激素或营养支持已发生退变，这样的取材往往细胞数量不多）;③重新制片时间（取隔天或几天前敞开的剩余标本，由于固定成分挥发，细胞核DNA因固定不好而丢失）；④常温超过2周的标本。
3、细胞数少，为什么？---------- ①医生取材不当（刷取细胞时圈数少于3圈，或力度太轻，或位置不当）；②病人在取材前2天内进行了阴道冲洗治疗、激素药物治疗，取材时使用润滑剂等；③制片离心前未混匀标本或制片时加样过少或太过稀释；④染色或水洗过程中细胞丢失，称为掉片；⑤炎症重或制片太厚细胞核多数重叠机器无法识别；⑥粘液成分较多，染色过程中粘液成分与细胞成块掉落。
4、为什么会掉片(细胞掉入溶液或水中)？------------ ①干燥过度（特别是用吹风机高温吹干或烤干所致）；②未充分干燥；③冲洗不当（水流过大或对着细胞位置冲洗或冲洗次数多）；④制片太厚；⑤血液成分过多；⑥凝胶样粘液成分较多；⑦细胞粘附性低(有些固定液的影响)。
5、 IOD值过高，为什么？（非特异性着色）----------- ①水中浸泡时间不够15分钟或漂洗水温过低；②染色温度过高；③冲洗效果未达到；
6、为什么会出现非特异性着色？（可出现增生样或假阳性）----------- ①常伴有IOD值低，常因为固定不好所致，BS液固定作用是固定DNA及封闭自由醛基；②见第5点。
7、 Mean IOD正常表明染色正常吗？------ 显然不是，mean IOD正常范围并不能代表染色的好坏，只是一个参考标准。如1、染液不过滤染出的制片mean IOD正常，反映的是整体光密度平均值，但是细胞核都有可能附上染液颗粒杂质而使其IOD增高，从而可能导致假阳性，因此染色上可认为是失败的；2、染色时漂洗时间不够或不漂洗，IOD值高，实际上如果正常漂洗IOD可能降至正常范围外的低值，那么实际上其染色是不正常的，结果导致了“正常”的错觉，非特异的着色会使结果不可靠，导致不少的假阳性或可疑病例，这点应特别注意。3、其它原因所致的非特异性着色，如固定不佳等。
8、细胞筛选要点有哪些？注意什么？----------前提是染色各步骤无错误，IOD合格的情况下，细胞筛选会变得相对容易；染色不正常的时候细胞筛选可能会比较难。原则：不要过“删”，避免漏诊；不要保“守”，避免假阳；要恰到好处，科学规范，简便易行。
①了解细胞核染色质可以出现的特点（DNA染色后的细胞核特点）：⑴染色质均匀分布；⑵细颗粒状或粗颗粒状；⑶分布不均；⑷碳墨状；⑸核膜可以不光滑、不规则、畸形或增厚；⑹可出现核沟；
②“核”半边染色深，半边浅或核中间出现多条规则条纹，应去除；
③“核”中间块状深染或多块，无染色质表现特点，应去除；
④双核或多核聚在一起，应酌情去除；
⑤核边缘模糊或一边清晰且核不透光（多为气泡中的细胞核），应去除；
⑥漆黑不透光或有一定透光性但边缘清晰，应做镜下复核；
⑦DI大于2.5，单个不确定的图像，应做镜下复核；
⑧核象“被水浸泡过质感”，深浅部分明显层次感“高低不平”或细胞核与背景很难区分开来，核膜不连续感，多半伴有IOD值低于标准，应去除；不符合发放标准时不宜发报告（强烈推荐）；
⑨圆形或类圆形、玻离状、泡状、空晕样、眼睛样、空白纸打点样“核”，无染色质表现，应去除；
⑩ 核上面大小不等的圆形或椭圆形空格玉米纹理样或斑点空泡状且背景脏乱，应去除；炎细胞、淋巴细胞、上皮细胞或精子细胞核覆盖需酌情去除；
9、粘液成分多怎么办？------ 没有DTT的情况下，可将有粘液的标本管放在涡旋式振荡器上振荡时间要长，至粘液成分打散，管内液体高速转动即可，那样离心后就不会有粘液悬浮的情况，粘液成分在上清部分，细胞被离心至离心管底部。如果未按上述操作，发现离心后的管内是漂浮在液体中的粘液成分，可将标本倒回标本管中后，如上操作后再次离心，或直接把离心管放在涡旋式振荡器上振荡混匀，看不到粘液悬浮后再次离心。标本管中粘液成分过多是因为医生取材时没有用棉签去除粘液所致，常导致标本不合格，有诊断意义的细胞往往少，需建议正确取材。