Her2 双色银染原位杂交(DISH)检测

(一)操作流程

1．常规石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗2minx2；

2．预处理：切片经热预处理和酶消化，蒸馏水洗2minx2，切片浸泡在0．1％DEPC水溶液中15rain，蒸馏水冲洗，梯度乙醇脱水，空气中自然干燥；

3．变性和杂交：在每张切片上滴加20ul地高辛和生物素标记的SpoT-Ligh易位杂交混合液，并加盖玻片，95℃变性6-8rain，迅速放在冰上5min，37℃湿盒中杂交16-24h：

4．杂交后洗涤；

5．免疫检测：切片需过氧化物酶灭活和CAS．Block试剂封闭(试剂盒内A液)10min，弃A液，每张切片滴加50ul(AP-抗Dig和HRP-Streptavidin等量混合液)室温孵育30-60min，TPBS洗3minx3；

6．显色：DAB／H202避光显色30min，经PBS洗后用碱性磷酸酶底物fastred显色8．12rain，蒸馏水冲洗2-5rain，滴加水溶性苏木精(Mayer'S苏木精)衬染10-30rain，经水洗后，切片上均匀滴加试剂F(Clearmount，试剂盒内提供)，60℃中1．5，2h，至其完全凝固，二甲苯洗3次，用I-Iistomount(新鲜配制)，封固。显微镜下高倍油镜观察、记录。

(二)结果判断100x10倍显微镜下观察：正常血管内皮细胞核内棕色颗粒和红色颗粒配对准确，ES／pPNETs的组织胞核内棕色颗粒和红色颗粒出现移位。

(三)操作体会

1．用存档蜡块进行CISH杂交前需用含50％甲酰胺的杂交液进行预杂交，30min左右，使因甲醛固定发生的DNA过度交联解链变性，提高DNA．DNA杂交效率。

2．杂交前增加0．I％DEPC水溶液作用15rain，可以强烈抑制因组织处理等过程而弥散分布的内源性核酸内切酶活性，可降低背景染色。

3．切片经熟处理和酶消化一定要适中，避免过度消化而使组织结构破坏，消化时间太短又使阳性率下降，要控制核膜出现皱褶为佳。

4．杂交变性条件的控制与杂交水平的提高是CISH成功的关键所在，认为用水蒸气作用要优于原位杂交加热仪。

5．地高辛和生物素标记的SpoT-Ligh易位探针和AP-抗Dig与HRP．Streptavidin等量混合液使用前要充分混匀，最好在混匀器上混匀，以保证最大限度地显示杂交信号。

6．用DAB和Fast Red显色时，显色液滴加在载玻片上可用盖玻片先封上，高倍镜下观察防止污染镜头，显色时间可延长到1h，镜下观察到阳性信号再用PBS浸泡，移去盖玻片。

7．显色后苏木精淡染，不要太深避免阳性信号被遮盖，不易观察。另外，务必注意阳性产物不能用盐酸乙醇分化、乙醇脱水和二甲苯透明，否则阳性信号会在一小时内溶解，因此必须按要求封片。