基因重排检测技术

1 基因重排检测技术的目的

检测淋巴组织增生性病变的克隆性起源,从而确定该病变性质。

确定淋巴系统肿瘤疾病的分型。

分析淋巴系统多发性肿瘤的起源同一性问题。

2  基因重排检测技术的原理

B淋巴细胞产生的抗原受体分子Ig和T淋巴细胞产生的抗原受体分子TCR，其编码基因在细胞的分化过程中均发生重排。通过基因重排，机体产生大量多样的重排构型，编码种类繁多的抗原特异性抗体。但对于一个个体及其后代，只含有其独特的重排构型，也就是说，一个T、B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记。大量的实验已证实，淋巴细胞肿瘤源于单克隆性增生。我们利用特定的引物对其基因进行扩增，当将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶（或琼脂糖凝胶）电泳时，多克隆淋巴细胞将产生一片弥漫带（见于反应性增生），而单克隆性增殖的淋巴组织则出现一明显条带（见于恶性淋巴瘤）。因此通过检测淋巴组织增生性病变的重排构型可以鉴别淋巴系统的肿瘤性和反应性增生，并确定细胞的来源。

本实验室采用天根生化科技有限公司或QIAGEN公司(QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit)的DNA提取试剂盒提取DNA。

3   标本

常规中性福尔马林固定（不超过12小时）、石蜡包埋，8 uM切片5~10片，直接将切下的组织薄片直接放在无菌的1.5ml一次性离心管（EP管）中，要求2~6管。

切片时要注意组织间的相互污染，切每一例组织前，要用75%的酒精棉球擦拭切片刀、切片机和镊子。

4   基因重排检测技术的操作流程

1、石蜡包埋组织DNA的提取　 

在装有蜡片的离心管内加入二甲苯1.3ml脱蜡，反复颠倒3分钟后12000转离心5分钟，弃上清。

后加入无水乙醇1.3ml将管内的水分去除。

再向管内加入二甲苯1.3ml脱蜡，反复颠倒3分钟后12000转离心5分钟，弃上清，重复二次。

后加入无水乙醇1.3ml置换二甲苯，反复颠倒3分钟后12000转离心5分钟，弃上清，重复二次，并晾干。

使用天根试剂盒：

新购买回来的试剂盒，部分试剂按说明书加入无水乙醇

在装有晾干组织的EP管内加200µl GA缓冲液、20µl蛋白酶K，充分混匀，在56℃水浴锅内放置1~3h，每小时颠倒混合样品2~3次。

加入200µl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应便清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清凉，说明细胞裂解不彻底，可能导致DNA量少或提取的DNA不纯。

加入200µl无水乙醇，充分混匀，简短离心以去除该内壁的水竹。

将上一步所得溶液和絮状沉淀加入一个吸附柱中（吸附柱放收集管）12000rpm（~13400×g）离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

向吸附柱中加入500µl缓冲液GD，12000rpm（~13400×g）离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

向吸附柱中加入700µl缓冲液PW，12000rpm（~13400×g）离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。

向吸附柱中加入500µl缓冲液PW，12000rpm（~13400×g）离心1min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。12000rpm（~13400×g）离心2min，倒掉废液。

将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

将吸附柱转入一个干净的EP管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200µl洗脱缓冲液TE，室温放置2~5min，12000rpm（~13400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中。

使用QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit：

新购买回来的试剂盒，部分试剂按说明书加入无水乙醇

在装有晾干组织的EP管内加180µl ATL缓冲液、20µl蛋白酶K，充分混匀，在56℃水浴锅内放置1~3h，每小时颠倒混合样品2~3次。

放置90℃ 1h。

简短离心，使EP管内的液体沉降。

加入200µl buffer AL于样品中，震荡混匀。然后加入200µl无水乙醇，再次混匀。

简短离心，使EP管内的液体沉降。

小心转移上述全部内容物于QIAamp MinElute column（放在2ml的接收管内），不需要湿润滤膜，盖上盖，12000rpm（~13400×g）离心1min，放置QIAamp MinElute column于另一个干净的2ml接收管内。

小心打开QIAamp MinElute column并加入500µl buffer AW1，不需要湿润边缘，盖上盖，12000rpm（~13400×g）离心1min，将QIAamp MinElute column放置于另一个干净的2ml接收管内，丢弃收集管里的洗脱物。

小心打开QIAamp MinElute column并加入500µl buffer AW2，不需要湿润边缘，盖上盖，12000rpm（~13400×g）离心1min，将QIAamp MinElute column放置于另一个干净的2ml接收管内，丢弃收集管里的洗脱物。

12000rpm（~13400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

将QIAamp MinElute column转入一个干净的1.5ml EP管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200µl洗脱缓冲液ATE，室温放置2~5min，12000rpm（~13400×g）离心2min，将溶液收集到EP管中。

将提取的DNA 混匀，用 NANO DROP2000 检测DNA的浓度和OD260/280，并用1%琼脂糖电泳跑胶，检测DNA的断裂情况。

2、引物合成   

3、PCR 扩增

 4、电泳及结果观察