组织原位杂交试验操作

【试验中自配试剂】

A、1×杂交增强液

    100×杂交增强液 ：蒸馏水=1:99 稀释    4℃备用

B、1×蛋白酶K工作液

蛋白酶K ：1×PBS=1:25 配制   （现配现用）

C、1×PBS

D、30﹪湿盒增效液

    湿盒增效液 ：蒸馏水=3:7

DAB显色液（现配现用）E ：D=1:50 避光保存，即2滴D+1ulE

【操作步骤】

        1、 切片处理

2、脱蜡及水化

3、杂交预处理

 HPV型（微波处理）

将切片放入盛有1×杂交增强液的容器里，微波高火状态煮30min，自然冷却2-3min，（加热过程中，溶液应始终浸没组织，建议适时每隔5-15min补充杂交增强液），蒸馏水洗涤

1×1min，小心擦干组织周围液体

 EBER型（蛋白酶K消化）

甩干切片，将组织周围液体用滤纸吸干，每张切片滴加适量1×蛋白酶K工作液（约50ul，根据组织的大小增、减量），室温孵育5-6min，蒸馏水洗涤1×1min，再用矿泉水冲洗，小心擦干组织周围液体

4、杂交

4.1 每张切片滴加适量杂交（液约20ul，根据根据组织的大小增、减量），加盖玻片，

4.2 变性

HPV型：放置于95℃原位杂交加热器上变性5min

EBER型：放置水温湿盒中，55℃恒温箱孵育60-90min

    4.3 切片放入含30﹪湿盒增效液的湿盒中，37℃下孵育4-16h，建议过夜（﹤16h ），以保证低拷贝样本的杂交效果

    4.4 48℃1×PBS（预温）浸泡切片，小心移去盖玻片，1×PBS洗5min

    4.5 48℃1×PBS 3×5min

【组织细胞原位显色试剂盒（DAB法）】

1、一抗  37℃水湿盒中30min，  37℃1×PBS 3×2min

2、二抗  室温水湿盒中20min，      1×PBS 3×2min

3、三抗（HRP聚合物） 室温，水湿盒中30min     1×PBS 3×2min

4、DAB显色液  室温，水湿盒中约10min，  1×PBS 3×2min

5、自来水冲，复染