HPV-L1操作流程

1、按IHC切片，常规脱蜡至水。

2、增加组织通透性和核酸探针穿透性及抗原热修复的酸洗涤：将G液（酸洗洗涤液×10）倒入能容纳整个玻片架的耐热塑料盒内，将塑料盒加盖在蒸锅内预至95-99℃后，并放入盒内使玻片完整侵入修复液中，加盖煮沸25min。之后将塑料盒（含玻片架）整体取出在室温下自然冷却25分钟。冷却后将玻片侵入洗液缸-1（F液：×20）内1分钟，取出玻片用后纸巾垂直吸干残余液体。

3、预杂交及内源性过氧化物酶消除：在玻片上滴两滴（100微升）过氧化氢阻断剂（A液），室温下静置5分钟，侵入洗液缸-2（F液）内1分钟，取出玻片用后纸巾垂直吸干残余液体。

4、非特异性染色消除：在玻片上滴两滴（100微升）非特异性染色封固液（H液），加盖玻片后在室温下静置5分钟。取下盖玻片，将玻片侵入洗液缸-2（F液）内1分钟，取出玻片用后纸巾垂直吸干残余液体。

5、外源性HPVL1抗体：在玻片上滴一滴（50微升）HPVBS-L1（B液），室温下静置30分钟至1小时。侵入洗液缸-3（F液）内1分钟，取出玻片用后纸巾垂直吸干残余液体。

6、DNA杂交及二次外源性抗体：在玻片上滴两滴（100微升）DNA探针标记聚合物及二抗混合液（C液），加盖玻片后在室温下静置30min。侵入洗液缸4（F液）内1分钟，取出玻片用后纸巾垂直吸干残余液体。

7、杂交后RNA酶处理及免疫组化的过氧化物酶处理：在玻片上滴两滴（100微升）过氧化酶及PNA酶液（D液），室温下静置15分钟。侵入新鲜洗液缸-5（F液）内1分钟，取出玻片用后纸巾垂直吸干残余液体。

8、杂交HRP染色和免疫组化AEC染色：在玻片上滴两滴（100微升）AEC色原液（E液），室温下静置15分钟。侵入蒸馏水缸内1min，取出玻片用后纸巾垂直吸干残余液体。

9、复染及返蓝：将玻片浸泡在Mayer’s苏木素内快速浸染15秒后将玻片浸入蒸馏水缸内2min。将玻片在0.037mol/L氨水促蓝液内快速熏染10次后将玻片浸入蒸馏水缸-4内5min。

10、封片：直接用水性封片剂封片。显微镜下阅片。

染色结果的观察：人乳头瘤病毒（HPV）L1壳蛋白为核蛋白质。所以只有细胞核呈红色染色才是特异性阳性染色。其它部位的红染均为非特异性染色。仅有一个被红染的细胞核即可诊断为HPVL1呈阳性。

注意事项：（1）AEC染色剂可以被有机溶剂溶解，所以醇溶性苏木精和二甲苯的封片剂都会造成染色消褪。故本染色必须用水溶性的苏木精和封片剂。（2）因为AEC染色在光线照射下一周后会褪色，因此染色后的玻片应室温暗盒保存。（3）在整个操作过程中应避免玻片干燥、（4）建议应在保质期内使用本试剂盒，超过保质期可能导致假阳性染色。

质量控制：（1）每次实验后应及时将试剂及时送回冰箱；（2）每试剂盒应作平行阳/阴性对照，本试剂盒所提供的阳性及阴性标本片子，应按说明书中的步骤相应减少第5和第6步。此外片内对照也是很好的阳性对照。