FISH操作步骤

一、所需试剂的配置

  1、ⅰ、20×SSC  PH5.3

氯化钠  88g     柠檬酸钠  44g   去离子水  400ul

充分溶解，室温下12M Hcl调节PH值至5.3用去离子水定容500ml，高压灭菌

ⅱ、2×SSC  PH7.0+-0.2

20×SSC  100ml   去离子水 800ml

 ⅲ、0.4×SSC（快洗）

     20×SSC 2ml    去离子水80ml

  2、固定液（甲醛液：冰醋酸体积=3：1）

  3、Kcl低渗溶液

Kcl 2.795g    去离子水 300ml  定容之500ml

  4、20mg/ml的胃蛋白酶存储溶液

20ug胃蛋白酶于1ml无菌水中，煮沸15min，冷却

二、操作步骤

  1、脱蜡至水

  2、1×PBS高压5min或96℃水浴30min

3、20ug/ml胃酶240ul于400ul 1 mol/LHCl中消化，15分起步。组织不宜消化的应加胃酶的量或用胃蛋白酶K消化5-6min。注意40就不要再消化了

240ul胃酶+400ul 1molHCl+40ml去离子水

4、2×SSC洗 2×5min

5、甲醛固定液10min（1ml甲醛+39ml1×PBS）

6、2×SSC洗2×5min

7、梯度乙醇脱水

8、加探针（2ul探针+8ul缓冲液）注：为了安全起见，用量是70﹪

9、封片，圈胶

10、进湿盒83℃，6min起步—10min

11、42℃恒温过夜

12、72℃0.4×SSC 洗90s，取盖玻片。注：0.4×SSC至少在冰箱放置30min

13、室温2×SSC洗1min

14、70﹪乙醇3min

15、晾干

16、加DAPI复染剂，加盖玻片

17、暗处处理10-20min后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察

注意：石蜡样本的处理方法一样，都和HER-2一样