一些固定剂的配方及性能介绍
固定，就是用某种方法双最快的速度将细胞杀死并保持组织及细胞原有的形态结构及其组成。固定在组织制片中极为重要，因为机体死后血液循环停止，细胞逐渐死亡，如不立即处理，则细胞内的酶（水解酶）会使蛋白质分解为氨基酸渗出细胞，使细胞溶解破坏，组织变形，在无冰藏的条件下，更可因其病原微生物的迅速繁殖而腐败，组织结构破坏，不利于形态学的诊断。
组织固定的目的为1、迅速防止组织、细胞死后变化，防止自溶与腐败，以保持和细胞与正常生活时的形态相似；2、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶解物质，以保持它原有的结构与生活时相仿；3、使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折光率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察；4、固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，增加组织硬度，便于制片；5、防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有的形态结构；经过固定的组织，能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。为了能够达到固定的目的，固定剂必须具备以下的性质和条件：1、迅速渗入组织而固定原生质，使短期解剖的组织细胞形态不至于有较大变化；2、固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定；3、使组织细胞中不至于因固定引起人为的改变；4、在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理，而使固定后的原生质变形；5、尽可能避免使组织膨胀或收缩（不致改变原生质原来的体积）；6、能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或沉淀下来；7、增加细胞内含物的折光度，易于鉴别，增加媒染作用和染色作用；8、使细胞变硬，适于切片，但又不使材料太坚硬或松脆；9、使组织充分固定，便于保存。[1][2]
下面我们介绍中华医学会病理分会推荐的几种常用固定剂的性能[3]：
1、 4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液
配方：甲醛（40%）100ml，无水磷酸氢二钠6.5g，磷酸二氢钠4.0g，蒸馏水900ml。
福尔马林不能使蛋白质及核蛋白凝固，但能保存脂类，可用于高尔基体、线粒体的固定，是糖的保护剂。对大多数抗原物质保存较好，对细胞膜的通透性有影响，可能使某些大分子抗原失去活性。福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩较少。
2、乙醇-甲醛（酒精-福尔马林，AF）固定液
配方：甲醛（40%）100ml，95%乙醇900ml。
酒精可以凝固蛋白质，但不能沉淀核蛋白，能溶解大部分脂类。酒精渗透速度快，胶水性强。除了固定作用外，还具有硬化和脱水作用。缺点是渗透力差，能使组织收缩，易挥发，容易吸收空气中的水分。酒精是一种还原剂，能被氧化成醋酸，不能与铬酸、锇酸及重铬酸钾等氧化剂配合成固定剂。
AF液兼有脱水作用，对皮下组织中肥大细胞固定好。
3、Carnoy固定液
配方：无水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。
醋酸，又称乙酸、冰醋酸。固定组织常用5%的溶液，能沉淀核蛋白，不能沉淀白蛋白、球蛋白，不能保存糖，也不能固定脂质，可使染色体保存较好。其穿透力强，渗透快。其缺点是使组织膨胀，特别对胶原纤维及纤维蛋白，高浓度的醋酸易破坏线粒体和高尔基体。
Carnoy液能固定胞浆和胞核，尤其适宜于染色体等。常用于粮原及尼氏体的固定，对显示DNA、RNA的效果好。固定液可防止乙醇的硬化及收缩作用，增加渗透力，特别适合外膜致密不易透入的组织。
4、Zenker固定液
配方：升汞5.0g，重铬酸钾2.5g，硫酸钠1.0g，蒸馏水100ml。
升汞（HgCl2），能使蛋白质及核酸沉淀，对脂类及多糖无固定作用，也不破坏脂类及多糖。其渗透速度快，穿透力较弱，对组织收缩较小。组织固定后染色质强烈与碱性染料结合，胞质内的结构也能被酸性或碱性染料着色。
重铬酸钾是强氧化剂，和合固定材料的浓度为1-3%，本身不能沉淀蛋白质，但可使蛋白质产生沉淀，未酸化的虽不能沉淀蛋白质，但可使蛋白质变为不溶性，保持与生活状态相仿，能固定类脂体，所以可以固定高尔基体、线粒体、脂肪，能溶解染色体，所以对核染色不良。酸化的使胞质及胞核沉淀呈网状，保存染色体，破坏线粒体。
Zenker固定液能使细胞核和细胞浆染色较为清晰。对细胞质固定好，显示某些细胞质内特殊颗粒有独特优越性，对胰岛和垂体前叶各种细胞的显示效果好，对骨髓等造血器官的固定效果好，红细胞可得到良好保存，对心肌的闰盘保存也有良好效果。
5、Bouin固定液
配方：饱和苦味酸水溶液（约1.22%）75ml，甲醛（40%）25ml，冰醋酸5ml。
苦味酸适合固定材料的浓度为饱和水溶液，能沉淀蛋白，对脂类无作用，不能固定多糖，渗透力弱，对组织收缩明显，不使组织硬化，固定组织容易着色。
Bouin固定液渗透力强，对组织固定均匀且收缩小，染色效果好，核着色鲜明，但细胞质着色差。用于固定大多数器官和组织，适用于结缔组织染色。
6、B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：
无水醋酸钠 1.25g，升汞6.0g，蒸馏水90ml，使用前加入甲醛10ml。
此液临时配制，适于固定胰腺组织，对鉴别胰岛细胞较好。
7、丙酮固定液
丙酮能使蛋白质沉淀，对多糖无固定作用，对核固定欠佳，渗透力强，使组织剧烈收缩。易挥发，易燃。广泛用于酶组织化学方法中各种酸的固定。
在工作及实验中我们也可能用与下面一些固定液[4]：
1、 Altmann液 配方：5%重铬酸钾水溶液10ml，2%锇酸水溶液10ml。用于固定线粒体，脂肪和白细胞。
2、 Aoyama液 配方：氯化镉1g，甲醛15ml，蒸馏水85ml。适宜于固定高尔基复合体。
3、 Champy液 配方：3%重铬酸钾70ml，1%铬酸70ml，2%锇酸40ml。用于固定线粒体和高尔基复合体。
4、 Dafano液 配方：硝酸钴1g，甲醛15ml，蒸馏水100ml。用于固定高尔基复合体。
5、 ECD-G液 配方：0.05mol/L PB 500ml，0.01mol/L PBS 500ml，Tris14g，浓盐酸少许，ECD10g，25%戊二酫 3.5ml。对蛋白质的固定有良好作用，用于培养细胞免疫细胞免疫电镜的良好固定液。
6、 Flemming液 配方：强渡：1%铬酸水溶液75ml，2%锇酸水溶液20ml，冰醋酸5ml。弱本1%铬酸水溶液25ml，1%冰醋酸（用前加入）10ml，蒸馏水60ml。适宜于高尔基复合体和线粒体的固定，强液用于固定脂肪组织。
7、 Goldsmith液 配方：1%铬酸水溶液15ml，2%重铬酸水溶液4ml，冰醋酸1ml。对鸟类胚胎固定佳。
8、 Heidenhain液 配方：升汞4.5g，氯化钠0.5g，蒸馏水80ml，三氯醋酸2g，冰酸酸4ml，甲醛20ml。对含较厚角质层的组织固定较好，如皮肤，蛔虫、昆虫幼虫等。
9、 Houseby液 配方：甲醛10ml，蒸馏水90ml，对苯二酚7g。对细胞质的微细结构保存好。
10、 Kanovsky液 配方：25%戊二醉醛10ml，40%甲醛5ml，0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液49ml，无水氯化钠50mg，蒸馏水33.5ml。适用于免疫电镜标本的固定，对细胞抗原性和细胞微结构的保存比用戊二酫好。
11、 Maximow液 配方：重铬酸钾2.5g，升汞5g，蒸馏水100ml，中性甲醛10ml。此液用甲酫代替Zenker液中的冰醋酸，对细胞质固定好，也可用于造血器官等组织的固定。
12、 Methacarn液 配方：甲醇60ml，氯仿10ml，醋酸10ml。适用于某些癌基因蛋白质产物和一些抗原的固定，如P53，PCNA的固定。
13、 Romeis液 配方：升汞饱和水溶液50ml，5%三氯醋酸水溶液40ml，甲醛10ml(用时加入)。可作为一般固定液应用，也可用于其他固定液固定后的再固定。有利于Heidenhain钱苏木精染色，有后媒染作用。
14、 Rossman 配方：无水乙醇苦味酸饱和液90ml，甲醛10ml。对糖原固定好。
15、 Verhoeff液 配方：甲醛水溶液10ml，95%酒精48ml，蒸馏水36ml，苦味酸1g。用于固定眼球。
16、 4%对苯醌 配方：对苯醌4g，0.05mol/L PBS 100ml。对抗原保存好，但对细胞超微结构有影响，一般应与醛类固定液混合使用。
17、 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）配方：多聚甲醛 40g，0.1mol/L磷酸缓冲液1000ml。该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
18、 PLP液（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液 配方：过碘酸钠，赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸），多聚甲醛，蒸馏水。配制方法：（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。过滤后4℃冰箱保存。（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。固定时间为6～18h。该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。
19、 甲醛-醋酸钠（钙）-升汞液 配方：甲醛10ml，醋酸钠或醋酸钙2g，升汞6g，蒸馏水90ml。用于固定胰腺组织，对鉴别胰岛细胞效果好。
20、 甲醛-钙液 配方：甲醛10ml，无水氯化钙1g，蒸馏水90ml。特别适用于固定脂肪组织和组织化学染色。
21、 甲醛-生理盐水 配方：甲醛10ml，生理盐水90ml。就用广泛的一种固定液，可保护脂类和细胞核。在酸性染色或三重染色之前可作二次固定。
22、 甲醛-溴化铵液 配方：甲醛15ml，溴化铵2g，蒸馏水85ml。为脑组织的良好固定液，可用于镀银和镀金染色。
23、乙醚-洒精液 配方：95%洒精49.5ml，乙醚49.5ml，冰醋酸1ml。固定液渗透性强，固定效果好，用于细胞涂片等固定。
一些固定剂的配方及性能介绍
固定，就是用某种方法双最快的速度将细胞杀死并保持组织及细胞原有的形态结构及其组成。固定在组织制片中极为重要，因为机体死后血液循环停止，细胞逐渐死亡，如不立即处理，则细胞内的酶（水解酶）会使蛋白质分解为氨基酸渗出细胞，使细胞溶解破坏，组织变形，在无冰藏的条件下，更可因其病原微生物的迅速繁殖而腐败，组织结构破坏，不利于形态学的诊断。
组织固定的目的为1、迅速防止组织、细胞死后变化，防止自溶与腐败，以保持和细胞与正常生活时的形态相似；2、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶解物质，以保持它原有的结构与生活时相仿；3、使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折光率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察；4、固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，增加组织硬度，便于制片；5、防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有的形态结构；经过固定的组织，能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。为了能够达到固定的目的，固定剂必须具备以下的性质和条件：1、迅速渗入组织而固定原生质，使短期解剖的组织细胞形态不至于有较大变化；2、固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定；3、使组织细胞中不至于因固定引起人为的改变；4、在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理，而使固定后的原生质变形；5、尽可能避免使组织膨胀或收缩（不致改变原生质原来的体积）；6、能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或沉淀下来；7、增加细胞内含物的折光度，易于鉴别，增加媒染作用和染色作用；8、使细胞变硬，适于切片，但又不使材料太坚硬或松脆；9、使组织充分固定，便于保存。[1][2]
下面我们介绍中华医学会病理分会推荐的几种常用固定剂的性能[3]：
1、 4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液
配方：甲醛（40%）100ml，无水磷酸氢二钠6.5g，磷酸二氢钠4.0g，蒸馏水900ml。
福尔马林不能使蛋白质及核蛋白凝固，但能保存脂类，可用于高尔基体、线粒体的固定，是糖的保护剂。对大多数抗原物质保存较好，对细胞膜的通透性有影响，可能使某些大分子抗原失去活性。福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩较少。
2、乙醇-甲醛（酒精-福尔马林，AF）固定液
配方：甲醛（40%）100ml，95%乙醇900ml。
酒精可以凝固蛋白质，但不能沉淀核蛋白，能溶解大部分脂类。酒精渗透速度快，胶水性强。除了固定作用外，还具有硬化和脱水作用。缺点是渗透力差，能使组织收缩，易挥发，容易吸收空气中的水分。酒精是一种还原剂，能被氧化成醋酸，不能与铬酸、锇酸及重铬酸钾等氧化剂配合成固定剂。
AF液兼有脱水作用，对皮下组织中肥大细胞固定好。
3、Carnoy固定液
配方：无水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。
醋酸，又称乙酸、冰醋酸。固定组织常用5%的溶液，能沉淀核蛋白，不能沉淀白蛋白、球蛋白，不能保存糖，也不能固定脂质，可使染色体保存较好。其穿透力强，渗透快。其缺点是使组织膨胀，特别对胶原纤维及纤维蛋白，高浓度的醋酸易破坏线粒体和高尔基体。
Carnoy液能固定胞浆和胞核，尤其适宜于染色体等。常用于粮原及尼氏体的固定，对显示DNA、RNA的效果好。固定液可防止乙醇的硬化及收缩作用，增加渗透力，特别适合外膜致密不易透入的组织。
4、Zenker固定液
配方：升汞5.0g，重铬酸钾2.5g，硫酸钠1.0g，蒸馏水100ml。
升汞（HgCl2），能使蛋白质及核酸沉淀，对脂类及多糖无固定作用，也不破坏脂类及多糖。其渗透速度快，穿透力较弱，对组织收缩较小。组织固定后染色质强烈与碱性染料结合，胞质内的结构也能被酸性或碱性染料着色。
重铬酸钾是强氧化剂，和合固定材料的浓度为1-3%，本身不能沉淀蛋白质，但可使蛋白质产生沉淀，未酸化的虽不能沉淀蛋白质，但可使蛋白质变为不溶性，保持与生活状态相仿，能固定类脂体，所以可以固定高尔基体、线粒体、脂肪，能溶解染色体，所以对核染色不良。酸化的使胞质及胞核沉淀呈网状，保存染色体，破坏线粒体。
Zenker固定液能使细胞核和细胞浆染色较为清晰。对细胞质固定好，显示某些细胞质内特殊颗粒有独特优越性，对胰岛和垂体前叶各种细胞的显示效果好，对骨髓等造血器官的固定效果好，红细胞可得到良好保存，对心肌的闰盘保存也有良好效果。
5、Bouin固定液
配方：饱和苦味酸水溶液（约1.22%）75ml，甲醛（40%）25ml，冰醋酸5ml。
苦味酸适合固定材料的浓度为饱和水溶液，能沉淀蛋白，对脂类无作用，不能固定多糖，渗透力弱，对组织收缩明显，不使组织硬化，固定组织容易着色。
Bouin固定液渗透力强，对组织固定均匀且收缩小，染色效果好，核着色鲜明，但细胞质着色差。用于固定大多数器官和组织，适用于结缔组织染色。
6、B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：
无水醋酸钠 1.25g，升汞6.0g，蒸馏水90ml，使用前加入甲醛10ml。
此液临时配制，适于固定胰腺组织，对鉴别胰岛细胞较好。
7、丙酮固定液
丙酮能使蛋白质沉淀，对多糖无固定作用，对核固定欠佳，渗透力强，使组织剧烈收缩。易挥发，易燃。广泛用于酶组织化学方法中各种酸的固定。
在工作及实验中我们也可能用与下面一些固定液[4]：
1、 Altmann液 配方：5%重铬酸钾水溶液10ml，2%锇酸水溶液10ml。用于固定线粒体，脂肪和白细胞。
2、 Aoyama液 配方：氯化镉1g，甲醛15ml，蒸馏水85ml。适宜于固定高尔基复合体。
3、 Champy液 配方：3%重铬酸钾70ml，1%铬酸70ml，2%锇酸40ml。用于固定线粒体和高尔基复合体。
4、 Dafano液 配方：硝酸钴1g，甲醛15ml，蒸馏水100ml。用于固定高尔基复合体。
5、 ECD-G液 配方：0.05mol/L PB 500ml，0.01mol/L PBS 500ml，Tris14g，浓盐酸少许，ECD10g，25%戊二酫 3.5ml。对蛋白质的固定有良好作用，用于培养细胞免疫细胞免疫电镜的良好固定液。
6、 Flemming液 配方：强渡：1%铬酸水溶液75ml，2%锇酸水溶液20ml，冰醋酸5ml。弱本1%铬酸水溶液25ml，1%冰醋酸（用前加入）10ml，蒸馏水60ml。适宜于高尔基复合体和线粒体的固定，强液用于固定脂肪组织。
7、 Goldsmith液 配方：1%铬酸水溶液15ml，2%重铬酸水溶液4ml，冰醋酸1ml。对鸟类胚胎固定佳。
8、 Heidenhain液 配方：升汞4.5g，氯化钠0.5g，蒸馏水80ml，三氯醋酸2g，冰酸酸4ml，甲醛20ml。对含较厚角质层的组织固定较好，如皮肤，蛔虫、昆虫幼虫等。
9、 Houseby液 配方：甲醛10ml，蒸馏水90ml，对苯二酚7g。对细胞质的微细结构保存好。
10、 Kanovsky液 配方：25%戊二醉醛10ml，40%甲醛5ml，0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液49ml，无水氯化钠50mg，蒸馏水33.5ml。适用于免疫电镜标本的固定，对细胞抗原性和细胞微结构的保存比用戊二酫好。
11、 Maximow液 配方：重铬酸钾2.5g，升汞5g，蒸馏水100ml，中性甲醛10ml。此液用甲酫代替Zenker液中的冰醋酸，对细胞质固定好，也可用于造血器官等组织的固定。
12、 Methacarn液 配方：甲醇60ml，氯仿10ml，醋酸10ml。适用于某些癌基因蛋白质产物和一些抗原的固定，如P53，PCNA的固定。
13、 Romeis液 配方：升汞饱和水溶液50ml，5%三氯醋酸水溶液40ml，甲醛10ml(用时加入)。可作为一般固定液应用，也可用于其他固定液固定后的再固定。有利于Heidenhain钱苏木精染色，有后媒染作用。
14、 Rossman 配方：无水乙醇苦味酸饱和液90ml，甲醛10ml。对糖原固定好。
15、 Verhoeff液 配方：甲醛水溶液10ml，95%酒精48ml，蒸馏水36ml，苦味酸1g。用于固定眼球。
16、 4%对苯醌 配方：对苯醌4g，0.05mol/L PBS 100ml。对抗原保存好，但对细胞超微结构有影响，一般应与醛类固定液混合使用。
17、 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）配方：多聚甲醛 40g，0.1mol/L磷酸缓冲液1000ml。该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
18、 PLP液（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液 配方：过碘酸钠，赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸），多聚甲醛，蒸馏水。配制方法：（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。过滤后4℃冰箱保存。（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。固定时间为6～18h。该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。
19、 甲醛-醋酸钠（钙）-升汞液 配方：甲醛10ml，醋酸钠或醋酸钙2g，升汞6g，蒸馏水90ml。用于固定胰腺组织，对鉴别胰岛细胞效果好。
20、 甲醛-钙液 配方：甲醛10ml，无水氯化钙1g，蒸馏水90ml。特别适用于固定脂肪组织和组织化学染色。
21、 甲醛-生理盐水 配方：甲醛10ml，生理盐水90ml。就用广泛的一种固定液，可保护脂类和细胞核。在酸性染色或三重染色之前可作二次固定。
22、 甲醛-溴化铵液 配方：甲醛15ml，溴化铵2g，蒸馏水85ml。为脑组织的良好固定液，可用于镀银和镀金染色。
23、乙醚-洒精液 配方：95%洒精49.5ml，乙醚49.5ml，冰醋酸1ml。固定液渗透性强，固定效果好，用于细胞涂片等固定。
温故而知新
