免疫组化（IHC）标准化 

                                                                                                                云南省第三人民医院病理科

                                                                                                                                              徐开军

免疫组化（IHC）是病理诊断的主要辅助手段之一。虽然免疫组化在各个实验室已经常规开展，但是由于各个实验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化实验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异。免疫组化染色技术操作步骤看似简单，但步骤较多且环环相扣，而且许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修复及修复液的PH值等众多因素。所以，完成一张满意的免疫组化切片并非那么简单。20世纪末，非生物素型聚合物（Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化实验室广泛应用。当前，免疫组化技术标准化的讨论是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并使用非生物素型聚合物检测方法的基础上而展开的。

1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。

（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败，凝固或沉淀组织、细胞内物质，以保持组织和细胞固有形态和结构。对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原，防止抗原破坏和弥散。需高度重视的是手术或穿刺离体组织必须马上放于标本袋固定，固定后应与病理申请单及时送交病理科。病理医生有责任与手术送检科室进行必要的配合与沟通，避免手术后的病理标本随意丢放。

由于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不同固定剂的特征。常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。由于中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此推荐作为病理标本的首选固定液。应避免使用含重金属的固定剂。

10%中性缓冲福尔马林配制方法：   

40%甲醛         100ml

磷酸二氢钠      4g

磷酸氢二钠      6.5g

蒸馏水          900ml

固定液的量一般为组织块总体积的5-10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本为18-24小时。固定时间不宜超过24小时，以防止组织经甲醛过度固定造成的组织抗原损失和抗原活性降低。

（2）取材：组织标本的取材厚度一般为0.3cm(不应>0.5cm)，面积一般为（1.0-1.5）cm x (1.0-1.5)cm。

（3）脱水：组织在脱水机中的处理需十分恰当，大量的实验室经验公认加热抗原修复过程中组织脱片的主要原因是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致。

（4）包埋与切片：组织经过脱水、透明及浸蜡后，进行石蜡包埋。包埋的石蜡过热或温度过高容易导致组织抗原的破坏，尤其对于固定不佳的组织，需选用低熔点的石蜡（熔点<60°C）。

（5）切片与展片：切片也是免疫组化染色的重要环节，一般厚度在3-5um之间，淋巴结/淋巴组织和肾穿组织切片应该更薄些。切片要求完整，厚薄均匀，无皱褶无刀痕，太厚会影响免疫组化染色结果和判断，还容易在染色过程中发生脱片。展片可采用二次展片，所谓二次展片：是指在展片过程中，先将组织切片漂浮在30%-40%的酒精溶液中，进行第一次展片，然后将切片捞起放入45-50°C的温水中进行第二次展片。此方法的优点是酒精溶液于水之间有一个张力差，这样处理可得到平整无皱褶的组织切片，但像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织接触酒精后会散开，不建议采用此法。

（6）烤片：推荐58-60°C恒温箱烤片2-3小时，但不能进行高温烤片，因为在干燥的条件下加热切片可以加速组织内抗原的氧化而破坏组织中的抗原，使抗原定位不明确。

（7）暂不染色切片的保存：进行免疫组化染色最好采用新切片。在实际工作中，蜡块面端可以采用蜡封来避免抗原损失以便长期保存。如果切好暂不染色的切片，应该将切片放置于4°C冰箱短时间保存。

（8）脱蜡：免疫组化的脱蜡过程与常规HE脱蜡步骤相同。

2、免疫组化抗体的选择、稀释和保存

（1）选择：

选择抗体应先了解其反应谱和适用条件（包括适用切片<石蜡切片或冰冻切片>、稀释度及温育时间等）。使用一种新抗体时，必须首先摸索出最佳滴度，所谓最佳滴度就是能获得最佳特异反应所需抗原的最低浓度。或者按照有关说明书的提示。

（2）稀释：

①一般用0.01M PBS，PH值7.2；

②或用0.05M TBS，PH值7.6；

③必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。

（3）保存：

合理地保存使用抗体十分重要，这样才能最大限度地发挥抗体的作用，使抗体不致在短期内失去活性。

①浓缩型抗体：应先根据厂家提供的效价，将其分类。可按5ul、10ul、20ul等至100ul为一单位分装入安瓿或0.25ml带盖塑料离心管中，并注明标记（批号、名称、效价、量），密封后放入-20°C — -40°C低温冰箱中保存，用时按需用量取出，稀释后置4°C冰箱保存使用，切勿反复冻存，以免效价降低。

②即用型抗体可置于4°C冰箱中保存。

远程运送，路途携带，邮寄抗体时，应加冰、干冰、防湿材料，以免影响效价。

3、免疫组化中被测组织的抗原修复

（1）组织细胞经10%中性缓冲福尔马林固定后，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，抗原结构的理化性质发生显著的改变，表位空间结构改变而导致许多抗原免疫活性丢失，影响了抗原的定位。目前在免疫组化实验中，抗原修复是影响染色结果的最关键因素之一。

常用的抗原修复方法是加热抗原修复法和酶消化法。有些抗体不需要进行抗原修复，有些抗体需要酶消化法，有些抗原需要加热修复法，有些抗体则需要几种抗原修复技术的联合应用（抗原双重修复法），至于哪种抗体是否需要抗原修复以及如何修复，一般试剂公司在产品目录或说明书上会予以说明。

（2）酶消化法：现免疫组化实验室中主要是胰酶消化法和胃酶消化法。

①胰蛋白酶消化法：浓度一般是0.05-0.1%，37°C下温育15-30分钟。

②胃蛋白酶消化法：浓度一般为0.04%，37°C下温育10-30分钟。

（3）加热抗原修复法：主要包括：高压法、微波法、水浴法。

英联邦免疫细胞化学室间质控组织（UK NEQAS-ICC）进行过一项由105家实验室参与，历时两年（1996年8月-1998年8月）的研究对ER、PR进行8次循环反馈实验，进行不同实验室间实验方法的比较的结论，就目前实验室间ER、PR染色结果偏弱的原因最终得出一致性实验结论，即由于微波加热时间不足与实验室中操作控制不当所致，故强烈推荐使用高压抗原修复方法。

抗原修复必须使用耐高温塑料切片架，不能使用铜染色架，以防止因修复液PH值改变抗原修复效果，修复结束后必须等修复液冷却至室温后，才能取出切片，取出后的切片需要用自来水充分洗涤，修复液的量必须保证所有切片都能浸泡到，无论哪一步骤都不能使切片干燥。用过的柠檬酸修复液或EDTA修复液不建议反复使用。影响抗原修复的基本因素是加热的温度和时间以及加热处理时浸泡切片的抗原修复液的PH。

（4）抗原修复液的选择：加热抗原修复液有多种，如柠檬酸修复液（PH6.0）、EDTA修复液（PH8.0-9.0）、EGTA（PH9.0）、Tris修复液（PH10.0），至于需要哪种修复液，应该根据试剂公司提供的产品目录或说明书上的预处理方法。

4、防脱玻片的制备：

由于免疫组化过程长，组织切片长时间浸泡在缓冲液和试剂内经过多次冲洗浸泡和作用，尤其是在抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等因素的影响，极易造成脱片，因此，必须在载玻片上涂上粘附剂，增加切片的粘附作用。一般采用多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）和APES两种粘附剂。

①多聚赖氨酸防脱玻片的制备

多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）         1份

蒸馏水                              9份

配制方法：取多聚赖氨酸1份，蒸馏水9份，置于干净的玻璃容器中，混合均匀，将充分洗净、预先干燥的玻片浸泡入稀释好的多聚赖氨酸中5-10秒，取出放置于室温下晾干或60°C干燥箱内烘干备用。处理后的玻片避光干燥可长期保存、备用。浓缩多聚赖氨酸液室温（18-26°C）贮存，有效期12个月。稀释后的工作液2°C-8°C冰箱保存，有效期3个月。

②APES玻片的制备：

APES             1份

丙酮             50份

配制方法：取APES1份，丙酮50份，置于干净的玻璃容器中，充分搅拌均匀。将洗净的玻片放入稀释好的APES液中20-30秒后取出，稍停，在放入纯丙酮液洗去多余的APES液，置通风橱中晾干即可。注意，用APES防脱玻片处理玻片捞片时组织应一步到位，不要留有气泡。浓缩液室温（18-26°C）贮存，有效期12个月。

Poly-L-Lysine（多聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作中最常用且效果最好的一种防脱片剂，多聚赖氨酸溶液也可按1：10稀释成工作液，适合于需要酶消化、微波、高压的防脱片处理。

5、免疫组化染色：

（1）内源性过氧化物酶的阻断：在一些细胞中存在过氧化物酶和过氧化氢酶等，它们能使H202分解，DAB沉积而着色，最常见的是红细胞（血红蛋白），另外还有横纹肌细胞（肌球蛋白）、粒细胞和单核细胞（细胞色素）、肝细胞和肾细胞（过氧化氢酶），如果不进行处理，组织中红细胞、粒细胞等会干扰染色结果的判断，消除内源性过氧化物酶干扰的办法就是将组织切片浸泡在3%的H2O2中10分钟。

（2）内源性生物素的阻断：抗原修复对组织中内源性生物素受到不同程度的封闭，在加热抗原修复增强抗原表位暴露的同时，也增强了组织中内源性生物素的呈现。内源性生物素指的是组织内能够与抗生素蛋白结合的分子或基团，使用生物素-链霉菌抗生素蛋白的结合形成足以以假乱真的阳性。

周小鸽等人2002年采用组织芯片技术对大范围的正常组织和肿瘤组织进行的系统性研究显示：①冰冻组织中存在生物素，②经福尔马林固定石蜡包埋后的组织中生物素被封闭，③加热抗原修复可造成生物素暴露，④生物素暴露的强度各不相同，强者可到强阳性（+++），⑤生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，⑥生物素在组织中的分布形式，特别是腺上皮组织，包括正常组织和肿瘤组织，亦存在部分非上皮组织，⑦生物素暴露的强弱与修复液亦有关，PH9.0EGTA的暴露能力比PH8.0EDTA和PH6.0的柠檬酸更强；⑧加热抗原修复暴露的生物素可以被蛋清液封闭。

周小鸽等人提出建议：凡采用加热抗原修复和生物素相关检测系统，应进行生物素常规封闭，冰冻切片做免疫组化染色时亦应进行生物素常规封闭，或者采用非生物素检测系统，如Envision等，坚持使用阴性对照。

在实验室中一般凡进行加热抗原修复处理并准备使用生物素-抗生素辣根过氧化物酶检测系统，免疫组化染色的组织都需要进行内源性生物素封闭处理。阻断内源性生物素的方法是采用卵白素-生物素（Avidin-biotin）加以封闭，在常温下孵育20-30分钟即可，Avidin-biotin可以与组织中内源性生物素结合，以消除影响。但最简便的方法是使用非生物素的酶聚合物检测系统。

（3）血清封闭：作为检测试剂的抗原蛋白带有一定的负电荷，免疫组化染色时，易与带正电荷的组织（特别是纤维组织、变性和<或>坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等）发生静电吸引而导致非特异性染色（实验室使用的封闭血清，一般在加一抗之前使用，选择的血清种属一般与二抗的种属相同），去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加一抗前，先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为1：5—1：20，正常血清保护作用时间10-20分钟。

（4）冲洗缓冲液：实验室中常用冲洗缓冲液为PBS和TBS（PH7.2-7.4）。冲洗缓冲液中加入0.025%Tween-20可以增强缓冲液的效果。

（5）一抗孵育：①即用型第一抗体可按照厂家提供的实验操作条件进行实验（迈新实验室针对即用型抗体稳定性与长期有效保存条件的问题进行了长达1年时间对照追踪实验观察,结果表明:即用型抗体在4°C冷藏条件下存放14个月是稳定的）;②浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度进行成倍稀释预实验,以选择最佳稀释度。抗体的最佳稀释度是指:在无背景染色的情况下,获得最佳强度阳性信号的抗体稀释度。一般染色背景深大多是抗体浓度过浓所致。③抗体孵育时的温度一般以25°C±8°C为准，在此区间内，一抗的孵育时间为30-60分钟。若温度较低应适当延长孵育时间，反之要适当减少孵育时间，或者在4°C冰箱过夜，冰箱4°C下孵育常需要注意的是：抗体孵育应在潮湿密封闭的环境中进行，避免抗体水分蒸发造成抗体的浓缩或干燥，致使染色背景产生。高质量的孵育盒是免疫组化的必要实验用品。

免疫组化染色过程的试剂浓度，孵育时间是相关联的，浓度与温度和时间基本呈反比，即浓度过高孵育，温度应越低，孵育时间应该越短，反之亦然，因此，每个实验室应根据各自的情况，合理处理三者的关系，摸索出一套适合自己的工作条件。

（6）常用检测系统：目前常用的检测系统为辣根过氧化物酶检测系统，主要为两类：①以生物素-链霉菌抗生物素蛋白链接的辣根过氧化物酶（Biotin-Streptavidin-HRP）检测系统，如：SP、ABC、SABC等；②以聚合物（Polymer）链接的辣根过氧化物酶检测系统，如：MaxVision、Elivision、EnVision等。这两类检测系统都是在国内外临床广泛采用的检测方法。非生物素型酶聚合物检测系统敏感性较高、操作便捷、无内源性生物素干扰，已成为免疫组化的常规检测系统。

（7）显色系统：由于通常采用的是辣根过氧化物酶，因此选择DAB（棕色）或AEC（红色）作为酶底物显色。若采用的是碱性磷酸酶检测系统则选择BCLP/NBT（蓝紫色）作为酶底物显色。

①DAB阳性部位呈棕色，一般以苏木素复染。配制DAB时应注意：<1>DAB具有致癌性，可诱发皮肤癌和膀胱癌，使用过程中勿将试剂沾到皮肤、眼睛或衣服上，若发生此情况应立即用大量的水冲洗，用过的DAB应倒入清洁液中集中消毒处理；<2>DAB一定要新鲜配制，如有沉淀可过滤后使用，否则未溶的DAB颗粒会沉积在切片上，影响结果的观察，配制好的的溶液避光保存，30分钟内有效；<3>DAB的浓度不宜太高，否则会增加背景染色。H2O2浓度也不宜太高，否则会加速反应，也可增加背景染色。

室温下染色约为3-5分钟，可在显微镜下观察控制染色时间。DAB试剂盒冰箱4-8°C避光保存。

②AEC阳性部位呈红色，如以苏木素或亮绿等作为背景染色，则效果更好，配制AEC时应注意：<1>配制AEC过程中勿将试剂沾到皮肤、眼睛或衣服上，若发生此情况应立即用大量的水冲洗；<2>由于终产物溶于乙醇中，不能用酒精处理，因阳性棕红色产物能溶于究酒精中，故需甘油明胶封片，不能长期保存。

<3>若出现沉淀可过滤后使用，配制好的溶液避光存放，30分钟内有效，染色结果为红色，室温下染色约为8-20分钟，可在显微镜下观察控制染色时间。AEC试剂盒冰箱4-8°C避光保存。

显色时间不宜过长，过长可导致背景着色，但也不宜过短，过短可导致假阴性染色。

（8）复染、脱水、透明、封固

免疫组化复染一般只需苏木素浅淡的染色（1-3分钟），苏木素的配方不同，但首选的是Harris苏木素衬染。在经0.1%盐酸酒精分化，自来水蓝化，常规脱水透明后封片。

6、标准化实验对照的设立

免疫组化对照实验的设立在免疫组织化标准化中是极其必要的，正确设立阳性、阴性对照，才能确保免疫组化染色过程的准确性、抗体及相关试剂有效性，是对技术人员实验操作和试剂供应商提供试剂质量的验证，也是对患者的负责。对照的设立包括试剂对照和组织对照，分别作为阳性和阴性对照。

（1）试剂对照：主要是为了确定所使用的一抗和检测试剂盒的特异性，替代对照是使用与一抗相同种属来源非免疫血清或其他免疫球蛋白代替一抗，或使用PBS代替一抗进行染色。Vimentin抗体可以作为免疫组化染色中一种很有用的阳性对照试剂，在每次免疫组化染色中加入Vimentin染色作为阳性对照，可以观察甲醛固定后抗原表达的敏感性，对甲醛固定后抗原损伤的程度进行分析。

（2）组织对照：组织对照实验有阳性对照、阴性对照和组织内部对照。

①阳性对照：对照组织中含有已知的抗原，常用的阳性对照有多组织蜡块、组织芯片等

②阴性对照：用确定不含有待测抗原的组织作为阴性对照组织

③组织内部对照：待测组织自身含有某种相关抗原，如淋巴结内一定含有血管内皮细胞，在观察外部阳性和阴性的同时，也要注意到内部的表达情况，有时候可以起到相当关键的作用。当然，有不少染色或病例缺乏内阳性对照，若对染色反应有疑问，只能选用另外的阳性对照片核实，若内（或外）阳性对照是组织免疫反应阴性，瘤组织阳性则表达假阳性；瘤组织阴性则表明假阴性，只有阳性对照染色阳性，瘤组织反应才属真实，除了观察内阳性对照外，还要看内阳性对照是否有非特异性反应。

7、免疫组化染色结果正确判读

实验室染色结果的观察、染色结果的判定需要丰富的经验，免疫组化染色最终是否能得到正确的结论，关键还要看对染色结果如何评价，在判断免疫组化染色结果时，为确保其准确性，必须要注意：

①首先应观察常规石蜡切片，形成初步诊断意见，在观察免疫组化染色结果时，应以有意义的组织/细胞为准，即主要观察有意义的组织/细胞的反应是阳性反应还是阴性反应；

②免疫组化染色结果必须建立在组织阳性对照和阴性对照实验有效的基础上，这是正确判断染色结果的前提。只有当阳性对照呈阳性反应，阴性对照呈阴性反应，且背景清晰时才能从正反两面说明抗体的稀释度和效价准确、染色方法和步骤准确无误、无交叉反应及非特异性染色；

③染色阳性结果应在预期的组织/细胞结构上定位清晰准确。阳性表达有强弱之分，只要在抗原的特定部位上，即使有少数细胞有抗原表达，也应视为阳性表达；

④阴性结果是组织细胞内预期区域中未见抗原表达；

⑤免疫组化染色结果为病理诊断辅助信息，当免疫组化染色结果与HE诊断不相符或发生矛盾时，应以HE诊断为标准，而不能简单的用免疫组化染色结果推翻、否定HE诊断，应在多做抗体标记并结合临床资料及实验室影像学检查等全面综合分析再做出正确诊断。

染色阳性的判断：

特别要注意内源性生物素造成的非特异性染色（如在肝、肾及富含线粒体的细胞等），常常表现为非特异的胞浆阳性。总之，只有阳性对照染成阳性，阴性对照基本阴性，这样的免疫组化染色结果才可信。

一般来讲，免疫组化染色阳性结果比阴性结果更有意义，因为阴性结果可能缘于许多因素，可能抗原的确不存在，或抗原含量低，组织处理时抗原丢失，染色方法不敏感或操作有误。

在免疫组化鉴别诊断过程中，大多数染色结果的判读为阳性或阴性即可，但在某些特殊情况下，如肿瘤组织中激素受体含量、分子靶向治疗药效，细胞增殖指数等进行免疫组化检测时，染色结果可用半定量计数法。

染色强度：（－）阴性、（±）弱阳性、（＋＋）中度阳性、（＋＋＋）高度阳性；

阳性细胞分布：（-）阴性、（＋）少数细胞阳性、（＋＋）中等细胞阳性、（＋＋＋）多数细胞阳性。

8、免疫组化报告

免疫组化实验报告已经融合在病理常规报告中，除了在本医院病理科与手术送检科室之间进行程序化的规范使用外，随着各个病理科实验室间的交流日益广泛，标准化的免疫组化报告已成为必不可少的交流资料。免疫组化实验报告中包括如下内容：

（1）病人的一般资料介绍；

（2）免疫组化检测系统

（3）注明所选择抗体的品名、克隆号、细胞定位及表达意义；

（4）实验对照的设立；

（5）医生对免疫组化结果的诠释。

最大限度、正确地叙述待测组织中抗原表达信息是病理免疫组化报告的基本要求。在条件允许下，病理免疫组化报告单应附有免疫组化染色图片。

参考书目

① 吴秉铨，刘彦仿主编.免疫组织化学病理诊断.北京：北京科学技术出版社，2007

②王学民，田乃增主编.免疫组织化学和分子生物学实用技术.北京：人民卫生出版社，2002

③中华医学会编著.临床技术操作规程病理学分册.北京：人民卫生出版社，2004

                                                                                                                                       2011年10月

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