(一)DEPC水

DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。DEPC即二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate)，可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPC 1ml，加入1L待处理水(蒸馏水等)中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC(DEPC分解为C0₂和乙醇)。试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1％-0.4％，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的容器的洗涤也需DEPC水洗涤。

注意：（1）DEPC是一种潜在致癌物质，操作中应通风条件下进行，避免皮肤接触。（2）含有Tris缓冲液的溶液中不能加入DEPC。

(二)载波片的处理

组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能任何核酸酶的污染。处理方法如下:

(1)先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水流水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水、双蒸水冲洗2—3次，置160℃以上烤箱中烘烤4h以上，或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。

(2)HCl处理法

玻片在室温下于1mol/L HCl中浸泡30min；DEPC水中洗片；95%乙醇洗片；空气中干燥。重复上述过程，铝箔包好备用。

（三）载片的包被

1．黏附剂有：

（1）多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine, PLL）

储备液（0.5%）

PLL      25mg

 

DEPC水  5ml

按上述剂量充分混合，即为浓度为5mg／m1(0.5％)的PLL液。常分装成1m1的包装，

-20℃存放。该液为储备液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。

工作液（0.01%）：

0.5% PLL      1ml

 

DEPC水      50ml

充分混合，静止待气泡消失。

（2）明胶液

明胶      2.4g

甲明矾    2.4g

DEPC水  1000ml

配法：先称取明胶溶于500—800ml DEPC水中，加热搅拌助溶，待明胶完全溶解以后，加入甲明矾溶解后即可使用。注意，包被玻片时，明胶液温度最好保持在60℃左右，效果最佳。方法同PLL包被玻片。

2．多聚赖氨酸包被玻片的制作方法(其它包被剂相同)

(1)将事先准备好的经160℃以上烘烤，并冷却至室温的玻片(载片或盖片)，在0.05％(也

有用0.1％)的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4℃备用。

注意：①浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象；②干燥过程中注意避免尘埃污染；③按上法处理的玻片通常可存放一定时间(室温1月以上，4℃更长)，但仍建议尽早使用。

以针对人Cathepsin B靶基因的mRNA序列为例。本试剂盒采用针对Cathepsin B的寡核苷酸探针，经地高辛标记。  可以检测出常规福尔马林固定，石蜡包埋标本的Cathepsin B之mRNA序列。针对Cathepsin B靶基因的mRNA序列为：

  (1)    5’—CATCC  CTCCC  TGTGA  GCACC  ACGTC  AACGG—3’；

  (2)    5’—GGCCA  TGCCA  TCCGC  ATCCT  GGGCT  GGGGA—3’；

  (3)    5’—GCTGG  AATTC  CACGC  ACCGA  TCAGT  ACTGG—3’；

大鼠、小鼠和人的序列有7bp／90bp不同。

适用种属：人、大鼠、小鼠组织。

试剂盒中内容

1．胃蛋白酶(×10；Pepsin ) 2m1；  2．预杂交液2m1；  3．以CATHEPSIN B寡核苷酸探针杂交液  2m1；    4．封闭液  5m1；    5．生物素化鼠抗地高辛  5m1；  

6．SABC—POD  5m1；7．生物素化过氧化物酶  5m1。

用户自备试剂：原位杂交专用盖玻片；Poly-L-Lysine ; DEPC；20％甘油；缓冲液(3％柠檬酸，2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC，  0.5×PBS)   

（一）、石蜡切片

准备工作液：缓冲液的配备

3％柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C₆K₈0₇·H₂0)3g，PH2.O左右。

2×SSC——l000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C₆H₅0₇Na₃·2H₂0，分294)8.8g

0.5×SSC——300ml蒸馏水加l00ml 2×SSC即可。

0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。

20％甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。

0.5M PBS一一l000ml蒸馏水加氯化钠30g， Na₂HP0₄·12H₂0  6g，  NaH₂PO₄·2H₂O

0.4g，PH7.2—7.6。

如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4％多聚甲醛／0.1M PBS(PH7.0—7.4)，含有l／1000DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定2小时即可，较大的标本固定不要超过4小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间一定不要超过2小时。

1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。

2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸。

3．石蜡切片经常规脱蜡至水。3％H₂0₂室温处理10分钟。蒸馏水洗涤2次。

4．暴露mRNA核酸片段：

切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃消化10-60分钟。可以比较不同的消化时间，例如10分钟，20分钟，30分钟和60分钟，以找到最佳的消化时间。0.5M PBS洗3次×5分钟。

5．预杂交：湿盒的准备一干的杂交盒底部加20％甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μl加预杂交液。恒温箱37-40℃ 2-4小时。吸取多余液体，不洗。

6．杂交——按每张切片20 μl杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱40-42℃杂交过夜c

7．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，30-37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；0.5×SSC洗涤15分钟×1次；0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×l-2次)。

8．滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗

9．滴加生物素化鼠抗地高辛：  37℃60分钟或20℃左右120分钟。0.5M  PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

10．滴加SABC：37℃20分钟或20℃左右30分钟。0.5M  PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。   

11．滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或20℃左右30分钟。0.5M  PBS洗5分钟×4次。

12．DAB显色：使用DAB显色试剂盒，用lml蒸馏水加显色剂A，B，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。

13．必要时苏木素复染，充分水洗。

14．酒精脱水，二甲本透明，封片。

（二）、培养细胞和冰冻切片

 

注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1％的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。

1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸。切片厚度20 μm。

2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5％的CO₂，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后O.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。

3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4％多聚甲醛／0.1M PBS(PH7.2—7.4)，含有l／l000 DEPC。室温固定30—60分钟。蒸馏水充分洗涤洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。

4．新鲜配制0.5％H₂0₂／甲醇室温处理30分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤3次。

5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃消化30—120秒钟。有时也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。