常用免疫组化染色要点


1、取材
     对于活检或手术切除标本应在2小时内取材或固定，避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化结果。
     取材时为避免挤压组织，尽量使用锋利刀片，并且避开坏死组织。取有代表性的肿瘤组织。
     2、固定
     标本用10%中性缓冲福马林固定液 (甲醛10ml + 0.01M ph7.4 PBS 90ml)固定12-18小时，不超过24小时。有些单位采用先固定标本后取材的工作程序。此时要注意，比较大的肿瘤应该切开固定，避免肿瘤中心部分固定不及时。
     3、脱水．透明、浸蜡、包埋、切片等
     按照常规方法用自动脱水机脱水、透明、浸蜡。注意温度不要超过60℃。
     玻片处理：彻底清洗，烤干后1:10多聚赖氨酸涂抹玻片，风干。
     组织切片厚度4-5微米。
     烤片50-60℃，2-3小时以上。
     常规脱蜡入水。
     4、常用检测系统选择
     SP三步法：敏感度大于EnVision、EliVision约1-2倍，但不宜用于富含亲生物素物质的组织，尤其对肝、肾组织很容易造成非特异性着色。
     EnVision、EliVision两步法：特异性强，可以避免生物素非特异性结合。
     5、免疫组化步骤
     抗原修复
     高温高压pH6.0柠檬酸盐缓冲液修复，适用于绝大多数抗原。
     需要用95℃热水浴EDTA（pH9.0）修复20分钟。适合于：CD10、CD138、Bcl-6、MuM1、VEGF、CD31、CD117、CD30、Cyclin D1、TdT、ALK。
     不需要修复的抗体：GST-π等。
     需要胃蛋白酶消化的抗体：EGFR，EBV。
     在此后整个染色过程中，切片不能干燥，否则会造成非特异着色。
     pH7.4 0.01M PBS（或者TBS）缓冲液浸洗切片5分钟×3次（下同）。
     室温下将切片浸入 3% H2O2溶液10分钟，以阻断内源性过氧化物酶作用（显色后红细胞如果着色，说明H2O2 浓度不够，不能抑制内源性酶）。
     PBS洗后拭去组织周围多余的水分，离组织切片周围约2mm处以防渗笔圈定。
     注意细节: 组织切面上水分不要过多；抗体液量适当；液体不能流离到组织外，玻片平置，等。
     滴加10%非特异性血清封片；也可以用5%蛋清（0.25ml蛋清 ＋ 4.75mlPBS + 50μl 20%NaN3 ）。
     或者用上述液体稀释第一抗体浓缩液，此时就不必再行“封片”这一步。
     二步法免疫组化中，尤其在使用即用型抗体时，也可以不用“封片”这一步。
     滴加一抗室温下孵育30分钟（也可以2小时或过中午）。注意：在冬天可以置于37%恒温箱内孵育。
     抗体浓度要经常注意用阳性对照片或自身对照，来证实其效价有无下降，如果下降，可以适当提高抗体浓度。
     PBS洗后，滴加EnVision或EliVision二抗室温下孵育30分钟（在冬天可以置于37℃恒温箱内孵育） 。
     有时阳性显色强度下降是由于二抗的效价下降，此时可以延长二抗孵育时间至1小时。
     室温下切片上滴加DAB显色剂10分钟（或者AEC 5分钟），镜下控制显色。
     水洗，苏木素复染；AEC显色用无酒精苏木素复染。
     烤干中性树胶封片；AEC显色用湿片AEC封片剂封片。
     6、阳性强度判断
     根据显色强度:阴性，可疑阳性±，弱阳性+，中阳性++，强阳性+++。
     国内目前习惯根据阳性细胞数量:阴性，＜ 25 %为+，25-50%++，50-75%+++, ＞75%++++。
     科研上半定量评分可以用阳性表达强度和阳性细胞数两者积分相乘。
     C-erbB-2阳性判别按国外厂家规定评定：无着色或＜10%肿瘤细胞弱着色为阴性，＞10%弱着色（+），也视为阴性，＞10%中等强度着色为阳性（++），＞10%强着色为阳性（+++）。