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- （转贴）细胞凋亡与检测技术
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| 作者：南方医科大学病理教研室 张进华 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 概 述 早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是创新性地提出的程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis）。 概念 细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmed cell death,PCD)，是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，并强调这一过程是一种自然的生理学过程。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以又被称为程序化细胞死亡。 随着对细胞凋亡研究的深入开展，大量的资料表明，PCD是多细胞生物体保证个体正常生理过程所必需的。通过细胞凋亡，机体得以消除不再需要的细胞，而不引起炎症反应。在哺乳动物的个体发育过程中，PCD也是广泛存在的，这种淘汰过程即是通过细胞凋亡实现的。发育过程中成熟组织的细胞发生凋亡的数量是惊人的，健康的成人体内，在骨髓和肠中，每小时约有10亿个细胞凋亡。由此可见，细胞凋亡是多细胞有机体生命活动过程中不可缺少的组成内容，在生物界普遍存在。 细胞坏死 一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。 特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症反应
细胞凋亡的生理意义 * 确保正常生长、发育 * 维持内环境稳定 * 发挥积极的防御功能 所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界关注的热点。 凋亡过程可大致分成4个阶段 * 凋亡信号转导 * 凋亡基因激活 * 凋亡的执行 * 凋亡细胞的清除 凋亡过程   凋亡过程Ⅱ  凋亡时细胞的主要变化 *形态学改变 *生化改变 光镜下：细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，核质浓缩，核膜核仁破碎，胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体。不引起周围的炎症反应。凋亡小体多呈圆形或卵圆形，大小不等，胞浆浓缩，强嗜酸性，有/无固缩深染的核碎片，故有时称之为嗜酸性小体。 凋亡时细胞的形态学改变    电镜下：凋亡的细胞皱缩，质膜完整，胞浆致密，细胞器密集，不同程度退变；核染色质致密，形成形状不一，大小不等的团块边集于核膜处，进而胞核裂解；胞浆发生芽突。胞浆芽突脱落后，形成许多凋亡小体。
生化特征： ①胞浆内Ca2+浓度升高。 ②细胞内活性氧增多。 ③质膜通透性增高。 ④DNA内切酶被激活，双链DNA在核小体之间切断形成180~200bp的特征性的有序片段。 ⑤Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和钙蛋白酶（Calpain）活性升高。 细胞凋亡的生化改变 ①DNA片段有规律的降解 ②细胞凋亡另一生物特征是DNA发生核小体间的断裂，结果产生含有不同数量核小体单位的片段，在进行琼脂糖凝胶电泳时，形成了特征性的梯状条带(DNA ladders)，其大小为180-200bp的整数倍； 而细胞坏死时，DNA随意断裂为长度不一的片段，琼脂糖凝胶电泳呈“弥散状”（smear ladders）条带。  典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳（呈现梯状条带）  凋亡相关因素 诱导性因素： 激素和生长因子失衡 理化因素：高温、强酸、强碱、抗癌药物 免疫因素 微生物学因素：细菌、病毒 抑制性因素： 细胞因子：IL-2，神经生长因子 某些激素 某些金属阳离子、药物 凋亡的调控 凋亡相关基因 抑制凋亡基因：Bcl-2，EIB， 促进凋亡基因：wtP53，Bax， 双向调控基因：c-myc，Bcl-x 凋亡与疾病 细胞凋亡与疾病的关系—— 该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。 细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫性疾病， 细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元退行性疾病，病毒感染 不足与过度并存：动脉粥样硬化 细胞凋亡检测 一、吖啶橙(简称AO)荧光染色法 原理：吖啶橙(Acridine Orange)是吖啶的衍生物之一。它是一种荧光染料，激发峰492nm，荧光发射峰530nm(DNA)，640nm(RNA)，它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光(给502nm)激发下，细胞核发亮绿色荧光(约530nm)，核仁和胞质RNA发桔红色荧光(＞580nm)。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。 (1)试剂 AO贮备液： AO 50mg(分析纯) 蒸馏水 50ml 4℃冰箱保存4个月。 Tris缓冲液： Tris 50mmol/L MgCl2 2.5mmol/L KCl 25mmol/L AO工作液： 将AO贮备液10:1用蒸馏水稀释，再用Tris缓冲液将AO稀释到8.5μg/ml的终浓度。 (2)操作步骤 ①取乙醇固定的细胞悬液，浓度为107/ml，1500r/min，5分钟，弃乙醇。 ②加入2ml AO工作液，室温染10分钟。 ③滴在载玻片上，加缓冲甘油封片。 ④在荧光显微镜下用吸收波长405nm，发射波长530-640nm观察。
结 果：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 二、Hoechst33258染色 Hoechst33258为特异性DNA染料，，与A-T键结合，但在pH2.0环境下则优先与RNA结合，染色DNA时应调整染液的pH至7.0，这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存。 本方法是用于培养细胞、细胞涂片或细胞甩片。 试剂及配制 (1)Hoechst33258贮存液：称取Hoechst33258试剂1mg，用20ml蒸馏水溶解后，滤过，4℃避光保存。用时蒸馏水10倍稀释成染色液。 (2) 0.01molPBS，pH7.2。 (3)封片液(pH5.5)：20mmol/L柠檬酸，50mmol/L 磷酸氢二钠，50%甘油。 (4)细胞固定液：甲醇/冰乙酸(3:1)，现配。 操作方法 (1)原代细胞培养、细胞学涂片或细胞甩片机制制备的单细胞片。 (2)细胞固定液4℃固定5min。 (3)蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。 (4)蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。 (5)封片剂封片后荧光显微镜观察。 结果：在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散、均匀荧光，坏死细胞不被Hoechst染色。出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化，如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞。
三、甲基绿-派诺宁染色法 (一)原理 细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态，但两者发生机制不同。细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA的损失。根据这一特点，可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。 (二)试剂及配制 1. 组织固定液 无水乙醇 600ml 氯仿 300ml 冰醋酸 100ml 2.甲基绿纯化 新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫。方法是将2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗，加入氯仿20ml充分，使其内的甲基溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉带比红色的氯仿移去，再加入新的氯仿10ml，如此反复更换氯仿，直到无紫红色为止。该液作为贮存液，4℃保存。 3.染色液 甲基绿贮存液 5ml 5%派诺宁水溶液 1ml 蒸馏水 12ml 0.2mol/L乙酸钠(pH4.8) 18ml 临用前配制，滤纸过滤。 (三)操作方法 1.新鲜取材组织置固定液中4℃固定3-6h(或培养细胞、细胞学甩片固定10min)。 2.直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。 3.切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水。(细胞学涂片不用梯度酒精) 4.置染色液中室温下染色约1h。 5.取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液。 6.插入丙酮中迅速分化。 7.转入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。 8.二甲苯透明2-3次。 9.中性树胶封固。 (四)结果 光学显微镜下凋亡细胞固缩，细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染，坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染。观察时可用凋亡指数进行计数，即随机选择约10-20个视野(每张切片约1000-2500个细胞)，计数凋亡细胞百分率。
四、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL) 原理：在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3?ˉ-OH末端。 末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)可以将地高辛标记的dUTP(DIG-dUTP)标记至3’-OH末端，DIG-dUTP(核苷酸)结合在DNA断点部位，可以通过生物标记的抗地高辛抗体(Anti-DIG-Biotin)反应后，再结合链酶亲和素-过氧化物酶(SABC)，然后加入显色底物DAB予以显示。凋亡的细胞核呈棕黄色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。  试剂 1.标记缓冲液(Labeling Buffer) 5×浓度的TdT反应缓冲液，含有以下成分： 500mmol/L二甲胂酸钾。pH7.2 10mmol/L CoCl2 (氯化钴) 1mmol/L DTT(二硫苏糖醇) 2.末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20) 3.DIG-dUTP(×20) 4.封闭液(Blocking Reagent) 5.生物素化抗地高辛抗体(×100) 6.SABC(×100) 7.ProteinaseK(×200) 8.抗体稀释液 9. 多聚赖氨酸或APES。 10. 0.01M TBS,PH7.5(配法：1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠，1.2克Tris和0.45-0.5ml纯乙酸。) 11. DAB显色试剂。 操作步骤 1.样品处理 (1)玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。 (2)细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0-7.6)室温下固定30-60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤2分钟×2次。 (3)组织：有条件时应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0-7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上，石蜡包埋。切片常规脱蜡入水(脱蜡务必干净)。 2.新鲜配制3%H2O2，室温处理10分钟。蒸馏水洗涤2分钟×3次。 3.标本片加0.01M TBS1:200新鲜稀释Proteinase K37℃消化5-15分钟，0.01M TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60秒钟。新鲜石蜡切片消化5-10分钟。陈旧石蜡切片消化10-30分钟)。 4.标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer)20μl/片，以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl，加入18μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2小时。 5.0.01M TBS洗2分钟×3次。 6.加封闭液50μl/片，室温30分钟，甩掉封闭液，不洗。 7.用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体：(取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl)，混匀后50μl/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30分钟。0.01M TBS洗2分钟×3次。 8.用抗体稀释液1:100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC10μl，混匀后50μl/片加至切片。37℃反应30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。 9.DAB显色。 10.苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。 结果判定细胞核固缩有的呈碎片状，不规则，大小不一致，呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。 即凋亡的细胞
TUNEL改良方法在细胞凋亡检测中的应用 材料和方法 1.1材料 取手术下新鲜组织，恒冷切片5μm，4%多聚甲醛缓冲液固定4-8小时，载玻片用APES处理，同时连续切片、1%火棉胶、0.01MPpH7.4PBS、3%H2O2、1.0M枸橼酸盐缓冲液、通透液(0.1%Triton-100、0.1枸橼酸钠)、标记缓冲液(pH6.8)：二甲胂酸钠100mmol/L标记、二巯基苏糖醇0.1mmol/L，氯化钴(coci)。 * TdT反应液；标记缓冲液(pH6.8)中加TdT酶100U/ml，biotin-dUTP；链霉菌素标记的辣根过氧化物酶，蛋白酶K(20μg/ml)。 * 显色剂 氨乙基咔唑(amino ethyl carbazole,AEC)的 配制 AEC 20mg 二甲酰胺DMF 2.5ml 0.05M醋酸缓冲液(pH5.5) 50ml 0.3%H2O2 0.5ml 1.2 实验步骤 （1）切片用冷风吹干后为防止冰冻切片脱片用1%火棉胶封片1分钟，PBS漂洗3×5分钟； （2）3%H2O2阻断10分钟后PBS洗3×5分钟； （3）组织切片浸泡于盛有1.0mol/L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中，置于微波炉内，在650W，辐射时间15min的条件下进行组织处理。冷却至室温。 （4）放在通透液（0.1%Triton -100溶于0.1%枸橼酸钠溶液）中室温20分钟，PBS漂洗3×5分钟； （5）滴加50μl TdT反应液37℃1h，PBS漂洗3×5分钟；(6)滴加50μl biotin-dUTP，反应液37℃1h，PBS漂洗3×5分钟；(7)滴加50μl链霉菌标记辣根过氧化物酶液37℃孵育30分钟，(8)PBS漂洗3×5分钟， AEC-H2O2显色10-15分钟，苏木素复染(用1%的酸性水分化)，水洗、水溶性封片。阳性对照dTd反应前用20μg/ml蛋白酶K处理切片。阴性对照用PBS代替dTd反应液。 1.3 结果判断及标准 改良的方法：凋亡细胞核呈红色固缩，有白边集或碎列，细胞膜皱褶，有的卷曲和出泡，在计数时避开坏死区域，以避免假阳性。计数500个细胞中的凋亡细胞数目，得出凋亡百分率。凋亡染色分度如下：每个高倍视野平均1-3个为Ⅰ级；3-6个为Ⅱ级；6-10个为Ⅲ级；>10个者为IV级。阳性对照：经在dTd反应认前用20μg/ml蛋白酶，处理切片30分钟的切片同改良方法基本相同，但红色较浅。阴性对照：切片无棕色反应。
评价 正常的或正在增殖的细胞没有DNA的断裂，没有3’-OH末端被标记，因此镜下无显色的物质。这种分子生物学与形态学相结合的方法，可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行标记，准确反应细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特征，灵敏度远远高于一般的组织化学和生物化学方法。在检测过程中，可设阴性对照(不加TdT)阳性对照(已知的阳性标本)。 注意:AEC孵育切片，反应产物为红色。可用苏木精对衬染色，反应产物是纯酒精溶性的，因此。可用酸性水溶液分化，然后用水溶性封固剂封片。 五、凋亡细胞：凝胶电泳检测 前已提及凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂。典型的细胞凋亡，在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段，而非典型的凋亡细胞，由于核内的DNA降解不完全，仅形成300~50kb的DNA大片。利用这一特性，可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况。 试剂 1. PBS缓冲液 2. 消化液的配制： 100mmol/L NaCl 10mmol/L Tris-HCL(pH8.0) 25mmol/L EDTA(pH8.0) 0.5%SDS 0.2mg/ml蛋白酶K 3. 酚：氯仿：异戊醇混合液按25:24:1比例配制。 4. 氯仿：异戊醇混合液按24:1比例配制。 5. 醋酸铵，7.5mol/L。 6. 100%和70%的乙醇。 7. TE 缓冲液(pH8.0)：100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA。 8. TBE缓冲液。 9. 电泳仪。 10. UV透射仪。 11. 照相设备。 12. 不含DNA酶的RNA酶。 13. 2%凝胶的配制：取凝胶粉2g，溶于100ml 0.5倍的TBE缓冲液中，加热至沸腾，搅拌使其均匀。待凝胶温度降至50℃时，倒入模板待其凝固。 14.溴化乙啶(EB)：10mg/ml水溶液。 15.DNA分子量标准物(Bio-Rad Lab，hercules,CA,USA)。 操作步骤 1.培养的悬浮细胞经离心(300g，5min)去上清液后，用冷(4℃)PBS缓冲液洗涤二次；培养的贴壁细胞经用胰蛋白酶消化后收集，同样方法洗涤二次，离心并去掉上清，仅留细胞沉积物。 2.向细胞沉积物中加入消化液，混匀后，于50℃孵育12-16h。 3.用酚：氯仿：异戊醇混合液抽提一次，再用氯仿：异戊醇混合液抽提二次。其中每次加入抽提液后混匀5min，然后以3600g离心5min，吸取抽提物。 4.向抽提物中加入 醋酸铵，至终浓度为2.5mol/L，混匀后，加入二倍体积的100%乙醇，4℃下静置2h。 5.将抽提物以12000g在室温下离心30min，弃去上清。 6.用70%乙醇重复上述步骤，洗涤一次，弃去上清。 7.真空抽干或空气干燥DNA抽提物。 8.将提取的DNA用TE缓冲液溶解。 9.取10μl溶于TB液的DNA抽提物，加入0.1U的无DNA酶的RNA酶，于37℃孵育1h。 10.吸取样品，在2%的凝胶孔内加样；并在第一孔内加入分子量标记物。 11.将凝胶置于0.5倍TBE缓冲液的电泳槽内，按4V/cm电压电泳7h。 12.将电泳后的凝胶置于0.5μg/ml的EB水溶液中染色30min。 13.用双蒸水洗涤凝胶1~2h，其间换水数次。 结果观察 将凝胶置UV透射仪上观察：典型的凋亡能看到200bp及其倍体的DNA梯带。 1阴性对照 2细胞色素诱导16小时 3细胞色素诱导36小时(凋亡) 4细胞色素诱导72小时(凋亡)   凝胶电泳特点 (1) 本方法不能检测单个细胞水平的凋亡。 (2) 不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态。 六、荧光染料染色-流式细胞测定凋亡细胞 * 细胞凋亡在细胞学上发生一系列特征性变化，如细胞周期停滞、细胞膜表面蛋白质分子表达的水平及类型发生改变、细胞膜皱缩引起光散射性质发生相应的变化等。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著下降，但是对90°角光散射的能力增加或没有变化。前向角散射的上升或下降与细胞的大小有关，90 °角散射的改变与细胞内结构，特别是染色质的浓缩有关。 * 在细胞凋亡晚期，前向角和右向角光散射的能力均降低。因此，通过流式细胞仪检测细胞光散射的改变可以获得凋亡细胞的一些信息。但是，细胞的机械损伤、分离获得的细胞核、以及坏死细胞的前向角光散射能力也均表现下降。另外，晚期凋亡细胞，细胞膜表面蛋白可能丢失，凋亡细胞表型复杂化也使光散射能力的分析出现复杂的结果，因此单纯前向角光散射降低不是凋亡细胞特有的标志。 * 根据碘化丙啶(PI)只能使坏死细胞着色，而双苯并咪唑(Ho)却可穿越细胞膜对活细胞和凋亡细胞的DNA进行染色，在紫外光激发下产生不同颜色荧光的特点，因此采用单一PI或者Ho染色法，或者应用两种染料通过复染并结合流式细胞仪的精确分析，可达到对凋亡细胞、坏死细胞和活细胞进行鉴别与定量的目的。 七、电子显微镜观察法 透射电子显微镜已经用于凋亡细胞的检测。镜下可见凋亡细胞体积变小、细胞质浓缩、细胞核变小、染色质浓缩并凝结成块，出现染色质沿核膜内侧排列的核边集现象。晚期的凋亡细胞，清晰可见细胞核裂解产生的凋亡小体。  八、PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测： 原理 凋亡早期，细胞内膜的磷脂酰丝氨酸(PS)移位到细胞外膜，而荧光标记或生物素偶联的annexin V(磷脂结合蛋白)极易检测处于外膜的PS，由于PS外膜化比凋亡引起的核酸变化更早，所以该试剂盒比DNA检测法能更早期检测细胞凋亡。 九、mRNA水平的检测 一些基因在细胞凋亡时表达异常，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。 作为凋亡前期（ Bax ）或抗凋亡（ Bcl-2和bcl-X ）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。因此，通过定量PCR（Quantative PCR）检测这些凋亡相关基因RNA水平的表达，也可以对凋亡进行评价 十、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 该分子表达广泛，在原核和真核生物不同种属间具有很高的同源性。该分子具有促进某些肿瘤细胞(HL60、MGC-803、MCF-7等)凋亡的效应，可作为早期凋亡的信号评价指标。 十一、活细胞Bid(蛋白)转位检测 Bcl2家族蛋白Bid通常情况下位于细胞浆内，但在凋亡发生时，Bid迅速转入线粒体内，并引发了细胞色素C的释放，因此，通过Bid蛋白的检测可以监视凋亡前期的生化反应。 细胞凋亡相关抗体 * Fas(CD95)Monoclonal Antibody * Granzyme B Monoclonal Antibody * Fas Monoclonal Antibody * Apoptosis Sample * Bak Antibody * Bcl-xL Antibody * Caspase-10 Antibody * Cleaved Caspase-3 * Cleaved DFF45(D224)Antibody * Cleaved PARP(D214)Antibody * DFF45/DFF35 Antibody * Phospho-Bcl-2(Ser70)Antibody 细胞凋亡的医学意义 1. 凋亡在发生学中的作用 ①在胚胎发育、器官形成过程中，必然伴随着某些特定细胞群的凋亡，这些细胞群的凋亡是受基因控制的，可准时发生，呈现生理性细胞死亡或进行性细胞凋亡。 ②淋巴系统的阴性选择(negative selection)，指在T淋巴细胞、B淋巴细胞分化成熟时，机体经过严格的选择机制，使那些编排细胞表面受体基因发生错误的细胞，以及有可能导致自身免疫性疾病的细胞(具有自身抗原的细胞)发生凋亡，使得淋巴细胞在成熟过程中，有95%的细胞以凋亡的方式被清除，仅有5%左右的淋巴细胞从中枢免疫器官中被分化成熟。 ③神经元发育过程中也存在阴性选择机制，以清除那些有害的(即发生错误连接的)或无用的神经元，因此，有50%的神经元细胞在发育成熟前以凋亡的方式被清除。 2.凋亡与疾病 现已发现凋亡机制的异常，即凋亡的增加或被抑制与一系列疾病的发生有关。 (1)凋亡减少(抑制)所引起的疾病 ①恶性肿瘤：有滤泡性淋巴瘤、P53突变性肿瘤、激素依赖性肿瘤(乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌)。 ②自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、自身免疫性肾小球肾炎。 ③病毒感染性疾病如对疱疹病毒、麻疹病毒、腺病毒易感性引起的疾病。 (2)凋亡增多引起的疾病 ①神经元变性，如帕金森病、侧索硬化、色素性视网膜炎、小脑变性。 ② 骨髓发育不良综合征，如再生性障碍性贫血。 ③ 缺血性损伤，如心肌梗死、卒中、再灌注性损伤。 ④ 中毒性肝炎，如酒精性肝病。 凋亡除与某些疾病发生有关，而且对许多疾病的治疗有着极大的现实意义。肿瘤患者可通过基因治疗启动细胞凋亡机制，也可通过药物(化疗)来诱导和加速肿瘤细胞凋亡，以控制肿瘤的发展，并使其缓解。如在外科手术及器官移植中的再灌注性损伤，可采取启动抗凋亡基因或应用抗凋亡药物，来促进愈合和恢复功能。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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