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病理常用研究方法-转贴

frankbj 离线

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楼主 发表于 2006-10-19 22:11|举报|关注(1)
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免疫组织化学染色的基本过程
•          标本的准备
•          标本的固定
•          组织脱水、浸蜡及包埋
•          切片
•          免疫组化染色
组织标本的取材和保存
•          取材时需用锋利器械,避免挤压
•          避开出血坏死区域
•          病灶、交界、正常部位
•          大小约为   1x1x0.2cm
•          及时固定
•          印片法
   将新鲜标本沿中心剖开,用载玻片轻压,细胞即黏附于玻片之上。
 
•          涂片法
   常用于淋巴结、软组织、肝、肾、肺等的细针穿刺,如组织较少,将组织推在玻片上,然后用另一玻片轻压涂片。
•          沉淀法
   主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等细胞较少的标本。将上述标本的瓶底自然沉淀液约5毫升离心,之后去掉上清,再涂片。
制备细胞玻片需注意
•          在印片或涂片前应涂胶,防止细胞脱落。
•          为节省试剂和便于观察,细胞应集中在直径0.6--1.0cm范围内。
组织和细胞标本的固定
•          使细胞内蛋白质凝固,减少细胞内分解酶的反应,防止细胞自溶。
•          保存组织和细胞内的抗原性,使抗原不失活、不弥散。
抗原分类
•          不稳定性抗原:T淋巴细胞表面抗原等。
•          半稳定性抗原:如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等。
•          稳定性抗原:HBSAg  AFP  CEA  Keratin  、 S-100等。
常用固定液
•          甲醛固定液
       10%福尔马林
       10%中性福尔马林(含碳酸钙)
       10%中性缓冲福尔马林(PBS
       其中以最后一种在免疫组化中最常用。
•          4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液
    较适用于免疫细胞化学染色。
注意事项
•          组织块大小  2*2*0.5cm
•          组织应及时固定
•          组织固定后必须彻底冲洗,除去残留固定液,一般用PBS缓冲液冲洗
影响固定的因素
•          温度:一般固定剂随温度升高固定能力增强,以室温最常用,某些酶需37度下固定,某些病毒需低温下固定。
•          浓度:10%中性甲醛,4%多聚甲醛最合适,乙醇最常用95%
•          固定时间:视组织块大小,固定液种类、浓度、温度而定。
常用的标记酶
•          辣根过氧化物酶
•          碱性磷酸酶
免疫组织化学方法
•          60年代发展起来的新方法,把抗原抗体免疫反应和酶催化作用结合起来,即吸收了免疫荧光、放射免疫的优点,又克服了它们的缺点。(1)不需要特殊的显微镜观察(2)定位准确,对比度好,染色标本可长期保存(3)可用苏木素等衬染,与形态结构结合观察(4)反应产物易分辨。
•          直接法:将酶结合在抗体上形成酶标记抗体,然后和抗原反应,再与酶的底物反应显色,在抗原抗体反应部位形成棕色或深棕色产物。
 
•          间接法:将酶标记在第二抗体分子上,一般免疫组化多采用此法。敏感性强
PAP法-过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法
•          抗原和第一抗体结合后,再滴加第二抗体和PAP复合物,最终形成抗原-一抗-二抗-PAP复合物。
•          一抗和PAP复合物中抗HRP抗体必须来自同一动物属。
•          PAP敏感性较高,较间接酶标法高20倍。背景染色也比较低。
亲和免疫组织化学技术
•          利用两种物质之间的高度亲和能力而相互结合的化学反应。亲和物不但相互之间有高度亲和力,与一些标记物如荧光素、酶、同位素、胶体金及铁蛋白等也有很强亲和力,从而可用荧光显微镜,酶加底物显色反应、放射自显影或电子显微镜观察。
•          常用的亲和物质包括:生物素、卵白素、植物凝集素、葡萄球菌A蛋白、IgG等。
ABC
•          生物素与酶结合,形成生物素化HRP,再与卵白素按一定比例混合,形成复合物ABC
•          该复合物再与生物素化抗体结合。
•          具体步骤:特异性一抗与组织中抗原结合形成抗原抗体复合物,生物素化二抗再与一抗反应,最后ABC和生物素二抗结合,形成抗原-抗体-生物素化二抗-ABC
免疫组化相关技术
•          抗原修复
•          酶消化法:如胰酶、蛋白酶
•          对部分抗体而非全部抗体有效。
•          对一些抗体十分必要:如BerEP4,CD21,CD35
•          如果固定时间过长,可能无效。
•          没有固定的消化时间,需要根据相应组织确定(固定时间越短,消化时间越短)。
•           
•          加热法:
 
水浴,微波,加压煮沸,高压锅,蒸气浴
•          声处理
•          综合使用上述方法
•           
•          检测系统
•          显色原的选择
•          抗体的选择
•          对照的使用
•          标准化与自动化
加热法优于酶消化法之处
•          染色结果更为恒定与一致;可以找到几乎适用于所有组织的处理时间。
•          一抗稀释倍数可以更高(省钱)
•          某些抗体只适用于加热法
适用于加热法的部分抗体
如果不加热修复则无
效的抗体
•           ER
•           PR
•          Bcl-2
•          TdT
•          Ki-67

•            cytokeratin                   
•            BerH2/CD30                                  
•            LCA/CD45                                      
•            L26/CD20                                       
•            Chromogranin                                
•            Myeloperoxidase                            
•            CEA
 

加热法抗原修复的注意事项
•          避免切片干涸(抗原可能完全丢失)。
•          加热后必须经过冷却(15-30’)(使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型)。
加压煮沸法
•          在非密封的压力锅中煮沸3升缓冲液
•          把切片架放入煮沸的液体中
•          密封压力锅使达到最大压力
•          达到最大压力后开始计算加热时间(推荐时间为2.5分钟;陈旧或固定时间长的标本为3分钟)
•          较微波法更有效
 
§ 可以同时处理更多的切片
 
§ 可达到更高的温度,因此更有效 (以更高倍数稀释抗体)
 
§ 加热均匀(避免了微波冷热不均
  
的现象)且节省时间
•          可能的缺陷:
 
质量差的加热锅有可能发生“爆炸”(塑料锅可能用于微波法中更安全?)
抗原修复法中的关键问题
•          充分的抗原修复是影响染色结果最重要的因素:比检测系统本身的敏感性更重要
•          要十分注意以下几个方面:
 
§ 加热温度
 
§ 加热时间
否则加热法可能对一些要求较高的抗体无效(如Ki67,PR
抗原修复法中潜在的问题
•          固定时间较短的组织用较强的修复方法(如加压煮沸法或长时间酶消化)可导致组织形态破坏或组织完全消化
•          解决方法:多次实验选择更短的加热或酶消化时间
内源性生物素:加热法中的难题
•          加热法可以使内源性生物素或生物素样物质活性加强,在卵白素-生物素检测系统中产生假阳性结果。
•          不要把内源性生物素导致的假阳性误为阳性结果。
•          假阳性常为暗褐色,绒毛状或颗粒状(可以色很深),但没有真正的膜阳性。
•          容易受其影响的组织:
              § 肝脏
              § 线粒体丰富的组织,如肾,Hurthle 细胞
              §  胞浆丰富的瘤细胞
 
•          解决方法:卵白素 -生物素阻断;使用其它检测系统,如PAP, APAAP,EnVision等。
•          多种修复液可供选择:pH6.0的枸橼酸缓冲液(最常用),尿素,Tris-Hcl等。
•          最近研究表明碱性修复液更有效。
•          推荐:Ph8.0,1mM的EDTA缓冲液。可用于大多数适用于加热法的抗体。

•           传统的阳性对照                                             
   § 在每组中设置已
  知为阳性的对照。                               
§ 确保所有试剂均
  有效,操作步骤正 
  确。

•           传统的阴性对照
§ 每例其中的一张切
  片由正常血清代替。
  § 目的在于判定非特
    异性染色的有无。

免疫组化在诊断中的应用
•          肿瘤鉴别诊断
•          判定癌的可能起源
•          癌症的预后因子
•          证实感染
•          宫内孕的诊断
•          其它 ……
肿瘤的鉴别诊断
•          梭形细胞肿瘤(梭形细胞癌、肉瘤)
•          小圆细胞肿瘤的鉴别(淋巴瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、小细胞癌)
•          透明细胞肿瘤(肾细胞癌、粘液表皮样癌、肌上皮癌、恶性黑色素瘤、印戒细胞癌)
•          其他
常用的抗体
•          Pan-cytokeratin——上皮性肿瘤
 
§ LCA ——淋巴瘤
 
§ S100 、Melin-A——恶性黑色素瘤
            § Vimentin---------肉瘤
            § NSE、CGA------神经内分泌肿瘤
            § Muscle、Myogenin-----肌源性肿瘤
 
角蛋白染色注意事项
角蛋白也可表达于非上皮性肿瘤中,这种表达常不规则:
              § 血管肿瘤,尤其是上皮样血管瘤和血
     
管肉瘤。
              § 淋巴结中单个指突状细胞(不要误为 
     
转移癌)。
      
§ 平滑肌或骨骼肌肿瘤
      
§ 肌纤维母细胞
      
§ 其它肿瘤
LCA染色注意事项
•          并非所有的淋巴造血系统肿瘤均表达LCA
•          浆细胞瘤常LCA 阴性
•          一些类型淋巴瘤常为阴性
 
§ 大细胞间变淋巴瘤
 
§ 淋巴母细胞淋巴瘤
•          如果LCA阴性仍不除外淋巴瘤,补染其它标记物
肿瘤诊断
•          可以对破碎或微小癌甚至不易察觉的病变(胃活检中印戒细胞癌 )进行诊断
§ 没有免疫组化,诊断或许难以进行。
§ 角蛋白染色可以清晰地显示癌细胞。
§ 寻找异常的染色区域:如不规则的岛状
 
、条索状结构或正常粘膜中散在单个细胞。
 
良性还是恶性?
      
§ B细胞/浆细胞增生性病变,如果出现轻
        
链限制性则支持恶性肿瘤。
      
§ 出现异常免疫表型,如B细胞同时表达
          CD43
,CD5或 cyclinD1则支持B细胞淋
              巴瘤的诊断。
      
§ 除个别例外,任何淋巴组织增生出现
          ALK1
表达,均提示大细胞淋巴瘤。
•          良性还是恶性?
增生标记物——Ki67
 
§ 如果在脑膜瘤、胃肠道间质肿瘤或甲 
         
状旁腺肿瘤中Ki67 指数很高,提示为
         
恶性。
      
§ Ki67染色可以帮助鉴别萎缩上皮(少
         
数细胞阳性)和CINIII(多数细胞阳性)
•          原位病变/良性病变还是恶性
  Actin
可以清晰地显示乳腺的肌上皮细胞
 
§ 乳头状瘤与导管内乳头状癌
 
§ 硬化性腺病与管状腺癌
 
§ 导管内癌是否有浸润性成分?
 
§ 导管内癌导致的硬化性腺病还是真正的
    
浸润性癌?
•          原位病变/良性病变还是恶性
用34BE12(高分子量角蛋白)标记前列腺基底细胞
 
§ PIN还是浸润性癌?
 
§ 局灶性不典型腺体或密集腺泡(如腺病或
   
硬化性腺病):良性还是前列腺癌
•          是否为肝细胞癌?
 
§ 肝细胞癌还是腺癌(原发/
    
移)?
 
§ CEA呈小管状阳性被用做肝细胞癌  的诊断依据。
是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤(如颗粒细胞瘤或支持细胞瘤)?
目前有以下几种性索细胞标记物:
  Inhibin
  CD99
  MART-1
(黑色素瘤相关标记物)
•          是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤(如颗粒细胞瘤或支持细胞瘤)?
目前有以下几种性索细胞标记物:
  Inhibin
  CD99
  MART-1
(黑色素瘤相关标记物)
•          浆膜腔活检或积液诊断中的难题:
 
§ 反应性间皮细胞还是腺癌?
 
§ 腺癌还是间皮瘤?
 
§ 最好的间皮细胞标记物:Calretinin
 
§ 鉴别诊断中最好的腺癌标记物:BerEP4
          CEA
•          神经内分泌肿瘤的分类
 
§ 诊断神经内分泌肿瘤必须有明确的全神
         
经内分泌标记物阳性:Syn和或CgA

      
§ 区分类癌与副神经节瘤:前cytokeratin +
              ,后者可见支持诊断的S100+细胞。
•          淋巴瘤分类
 
§ 确定瘤细胞谱系:L26 (B细胞),CD3
      (T细胞),CD56(NK 细胞)
 
§  淋巴母细胞瘤:TdT
 
§ 套细胞淋巴瘤:Cyclin D1
 
§ 滤泡性淋巴瘤:CD10 或 bcl-6
 
§ 间变性大细胞淋巴瘤: CD30,ALK1 
 
§ Burkitt 淋巴瘤:Ki67 (几乎100%细胞阳
  
性)
胸腺瘤分类
 
§  胸腺瘤还是淋巴瘤:Cytokeratin 和 LCA
    
最有用
 
§ 胸腺瘤还是胸腺癌
   1
)TdT+淋巴细胞 支持胸腺瘤的诊断。
   2
)如果上皮细胞CD5+,支持胸腺癌的诊断。
 
§ 是否是胸腺瘤:有TdT+性淋巴细胞存在或
   
上皮细胞表达CD20,提示为胸腺瘤
•          胃肠道间质肿瘤分类
 § 胃肠道间质肿瘤:最常见的表型:c-kit+,  actin-,desmin-
 
§ 平滑肌肿瘤:c-kit-,actin+,desmin+
 
§ 雪旺氏瘤:c-kit-,actin-,desmin-
     S100+
•          软组织肿瘤分类(标记物非常有限)
        § 纤维组织细胞瘤没有可靠的标记物  
 
§ S100:神经鞘瘤
 
§ EMA:滑膜肉瘤
 
§ Actin,desmin:肌源性肿瘤
 
§ Cytokeratin:滑膜肉瘤,上皮样肉瘤,横
  
纹肌样瘤
•          软组织肿瘤分类
 
§ CD31:血管肿瘤 
 
§ CD34:血管肿瘤,孤立性纤维瘤,
          DFSP血管周细胞瘤,梭形细胞脂肪瘤 
 
§ Syn:  PNET
 
§ CD99:尤文氏肉瘤/PNET
•          分期
淋巴结或骨髓中检测出微小转移灶,
  提示预后不良:
判定癌瘤原发部位的
免疫组化标记物
•          器官特异性标记物:
 § 甲状腺球蛋白:甲状腺
 
§ 降钙素:甲状腺
 
§ PSA或PAP:前列腺
 
§ 表面活性物质:肺
 
§ BRST-2/GCDFP-15:乳腺
 
§ HEP-PAR1:肝
判定腺癌原发部位的
免疫组化标记物
•          CK7:除胃肠道外,大多数腺癌均为阳性表达
•          CK20:仅胃肠道 和女性生殖道腺癌、粘液腺癌为阳性表达。
•          PE-10(表面活性物质):50%肺腺癌阳性
•          TTF-1(甲状腺转录因子-1):80%以上肺腺癌阳性
•          CA125:阳性表达提示女性生殖道起源 (偶尔肺、乳腺、胰管胆管 癌可呈阳性表达)
•          BREAT-2(GCDFP-15):50%乳腺癌阳性
•          甲状腺球蛋白:甲状腺起源
•          PSA:前列腺起源
判定鳞癌原发部位的免疫组化标记物
•          由于不同部位的鳞癌不表达不同表型,因此没有太多可用的标记物.
•          CD5:阳性表明胸腺起源
•          CD20:阳性提示膀胱移行细胞癌
•          原位杂交检测EB病毒:阳性提示鼻咽癌或EB 相关癌
判定小细胞癌原发部位的
免疫组化标记物
有几种可用的标记物:
 
§ CK20:Merkel细胞癌为阳性(原发涎腺肿
   
瘤也可阳性)
 
§ TTF-1:原发肺小细胞癌阳性
癌预后因子
•          激素受体:乳腺癌
•          增殖标记物(Ki67)是某些肿瘤的预后因子
•          癌基因与抑癌基因产物:c-erbB2, Rb,p16, p27, p21, ALK1.
ER/PR 判断标准:
≥5%/ 预后好(Favorable)
1-4% 交界性 (Borderline)
阴性/预后差(Negative/Unfavorable
确定感染
•          免疫组化可判定某些感染的实质 (有时病毒包含体难以发现)
 Herpes
 CMV
 HPV
 HBsAg
 Pneumocystis
宫内孕的诊断
•          宫腔刮出物中证实有胎儿成分可有效的排除输卵管妊娠。
•          如果不见绒毛,角蛋白染色可显示蜕膜细胞中的滋养叶细胞,从而证实为宫内孕
 
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197 离线

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1 楼    发表于2006-10-22 21:37:00举报|引用
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贴得好!
老师辛苦了。

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意义 离线

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2 楼    发表于2006-10-28 14:09:00举报|引用
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节能王 离线

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节能王 离线

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病理人 离线

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wangdingding 离线

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6 楼    发表于2008-12-28 22:19:00举报|引用
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天山望月 离线

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广州金域病理

lunye888 离线

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8 楼    发表于2009-04-19 10:59:00举报|引用
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xiexie

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lunye888 离线

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9 楼    发表于2009-04-19 10:59:00举报|引用
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xiexie

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lunye888 离线

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xiexie

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勇敢一点 离线

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11 楼    发表于2009-04-25 21:38:00举报|引用
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真正的美玉总是存在瑕点,哪怕是极其微小的;只有赝品才美得让人无可挑剔.

勇敢一点 离线

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12 楼    发表于2009-04-25 21:44:00举报|引用
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真正的美玉总是存在瑕点,哪怕是极其微小的;只有赝品才美得让人无可挑剔.

天天进步 离线

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13 楼    发表于2009-04-26 21:52:00举报|引用
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 老师辛苦了,收藏!谢谢!
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14 楼    发表于2009-05-21 10:38:00举报|引用
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 小帅哥非常精神,天庭饱满、笑容可掬,今后当是高官厚禄啊。
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“人生没有彩排,每一天都是现场直播”

sandy 离线

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好极了

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永恒爱恋 离线

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16 楼    发表于2010-02-02 19:47:00举报|引用
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 太好的东西了,感谢您
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只要你的脚还在地面上,就别把自己看得太轻;只要你还生活在地球上,就别把自己看得太大

梦里夏花 离线

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17 楼    发表于2010-03-09 22:14:00举报|引用
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