免疫组织化学染色的基本过程
8226; 标本的准备
8226; 标本的固定
8226; 组织脱水、浸蜡及包埋
8226; 切片
8226; 免疫组化染色
组织标本的取材和保存
8226; 取材时需用锋利器械,避免挤压
8226; 避开出血坏死区域
8226; 病灶、交界、正常部位
8226; 大小约为 1x1x0.2cm
8226; 及时固定
8226; 印片法
将新鲜标本沿中心剖开,用载玻片轻压,细胞即黏附于玻片之上。
8226; 涂片法
常用于淋巴结、软组织、肝、肾、肺等的细针穿刺,如组织较少,将组织推在玻片上,然后用另一玻片轻压涂片。
8226; 沉淀法
主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等细胞较少的标本。将上述标本的瓶底自然沉淀液约5毫升离心,之后去掉上清,再涂片。
制备细胞玻片需注意
8226; 在印片或涂片前应涂胶,防止细胞脱落。
8226; 为节省试剂和便于观察,细胞应集中在直径0.6--1.0cm范围内。
组织和细胞标本的固定
8226; 使细胞内蛋白质凝固,减少细胞内分解酶的反应,防止细胞自溶。
8226; 保存组织和细胞内的抗原性,使抗原不失活、不弥散。
抗原分类
8226; 不稳定性抗原:T淋巴细胞表面抗原等。
8226; 半稳定性抗原:如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等。
8226; 稳定性抗原:HBSAg AFP CEA Keratin 、 S-100等。
常用固定液
8226; 甲醛固定液
10%福尔马林
10%中性福尔马林(含碳酸钙)
10%中性缓冲福尔马林(PBS)
其中以最后一种在免疫组化中最常用。
8226; 4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液
较适用于免疫细胞化学染色。
注意事项
8226; 组织块大小 2*2*0.5cm
8226; 组织应及时固定
8226; 组织固定后必须彻底冲洗,除去残留固定液,一般用PBS缓冲液冲洗
影响固定的因素
8226; 温度:一般固定剂随温度升高固定能力增强,以室温最常用,某些酶需37度下固定,某些病毒需低温下固定。
8226; 浓度:10%中性甲醛,4%多聚甲醛最合适,乙醇最常用95%
8226; 固定时间:视组织块大小,固定液种类、浓度、温度而定。
常用的标记酶
8226; 辣根过氧化物酶
8226; 碱性磷酸酶
免疫组织化学方法
8226; 60年代发展起来的新方法,把抗原抗体免疫反应和酶催化作用结合起来,即吸收了免疫荧光、放射免疫的优点,又克服了它们的缺点。(1)不需要特殊的显微镜观察(2)定位准确,对比度好,染色标本可长期保存(3)可用苏木素等衬染,与形态结构结合观察(4)反应产物易分辨。
8226; 直接法:将酶结合在抗体上形成酶标记抗体,然后和抗原反应,再与酶的底物反应显色,在抗原抗体反应部位形成棕色或深棕色产物。
8226; 间接法:将酶标记在第二抗体分子上,一般免疫组化多采用此法。敏感性强
PAP法-过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法
8226; 抗原和第一抗体结合后,再滴加第二抗体和PAP复合物,最终形成抗原-一抗-二抗-PAP复合物。
8226; 一抗和PAP复合物中抗HRP抗体必须来自同一动物属。
8226; PAP敏感性较高,较间接酶标法高20倍。背景染色也比较低。
亲和免疫组织化学技术
8226; 利用两种物质之间的高度亲和能力而相互结合的化学反应。亲和物不但相互之间有高度亲和力,与一些标记物如荧光素、酶、同位素、胶体金及铁蛋白等也有很强亲和力,从而可用荧光显微镜,酶加底物显色反应、放射自显影或电子显微镜观察。
8226; 常用的亲和物质包括:生物素、卵白素、植物凝集素、葡萄球菌A蛋白、IgG等。
ABC法
8226; 生物素与酶结合,形成生物素化HRP,再与卵白素按一定比例混合,形成复合物ABC
8226; 该复合物再与生物素化抗体结合。
8226; 具体步骤:特异性一抗与组织中抗原结合形成抗原抗体复合物,生物素化二抗再与一抗反应,最后ABC和生物素二抗结合,形成抗原-抗体-生物素化二抗-ABC
免疫组化相关技术
8226; 抗原修复
8226; 酶消化法:如胰酶、蛋白酶
8226; 对部分抗体而非全部抗体有效。
8226; 对一些抗体十分必要:如BerEP4,CD21,CD35。
8226; 如果固定时间过长,可能无效。
8226; 没有固定的消化时间,需要根据相应组织确定(固定时间越短,消化时间越短)。
8226;
8226; 加热法:
水浴,微波,加压煮沸,高压锅,蒸气浴
8226; 声处理
8226; 综合使用上述方法
8226;
8226; 检测系统
8226; 显色原的选择
8226; 抗体的选择
8226; 对照的使用
8226; 标准化与自动化
加热法优于酶消化法之处
8226; 染色结果更为恒定与一致;可以找到几乎适用于所有组织的处理时间。
8226; 一抗稀释倍数可以更高(省钱)
8226; 某些抗体只适用于加热法
适用于加热法的部分抗体
如果不加热修复则无
效的抗体
8226; ER
8226; PR
8226; Bcl-2
8226; TdT
8226; Ki-67
8226; cytokeratin 8226; BerH2/CD30 8226; LCA/CD45 8226; L26/CD20 8226; Chromogranin 8226; Myeloperoxidase 8226; CEA |
加热法抗原修复的注意事项
8226; 避免切片干涸(抗原可能完全丢失)。
8226; 加热后必须经过冷却(15-30’)(使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型)。
加压煮沸法
8226; 在非密封的压力锅中煮沸3升缓冲液
8226; 把切片架放入煮沸的液体中
8226; 密封压力锅使达到最大压力
8226; 达到最大压力后开始计算加热时间(推荐时间为2.5分钟;陈旧或固定时间长的标本为3分钟)
8226; 较微波法更有效
§ 可以同时处理更多的切片
§ 可达到更高的温度,因此更有效 (以更高倍数稀释抗体)
§ 加热均匀(避免了微波冷热不均
的现象)且节省时间
8226; 可能的缺陷:
质量差的加热锅有可能发生“爆炸”(塑料锅可能用于微波法中更安全?)
抗原修复法中的关键问题
8226; 充分的抗原修复是影响染色结果最重要的因素:比检测系统本身的敏感性更重要
8226; 要十分注意以下几个方面:
§ 加热温度
§ 加热时间
否则加热法可能对一些要求较高的抗体无效(如Ki67,PR)
抗原修复法中潜在的问题
8226; 固定时间较短的组织用较强的修复方法(如加压煮沸法或长时间酶消化)可导致组织形态破坏或组织完全消化
8226; 解决方法:多次实验选择更短的加热或酶消化时间
内源性生物素:加热法中的难题
8226; 加热法可以使内源性生物素或生物素样物质活性加强,在卵白素-生物素检测系统中产生假阳性结果。
8226; 不要把内源性生物素导致的假阳性误为阳性结果。
8226; 假阳性常为暗褐色,绒毛状或颗粒状(可以色很深),但没有真正的膜阳性。
8226; 容易受其影响的组织:
§ 肝脏
§ 线粒体丰富的组织,如肾,Hurthle 细胞
§ 胞浆丰富的瘤细胞
8226; 解决方法:卵白素 -生物素阻断;使用其它检测系统,如PAP, APAAP,EnVision等。
8226; 多种修复液可供选择:pH6.0的枸橼酸缓冲液(最常用),尿素,Tris-Hcl等。
8226; 最近研究表明碱性修复液更有效。
8226; 推荐:Ph8.0,1mM的EDTA缓冲液。可用于大多数适用于加热法的抗体。
8226; 传统的阳性对照 § 在每组中设置已 知为阳性的对照。 § 确保所有试剂均 有效,操作步骤正 确。 |
8226; 传统的阴性对照 § 每例其中的一张切 片由正常血清代替。 § 目的在于判定非特 异性染色的有无。 |
免疫组化在诊断中的应用
8226; 肿瘤鉴别诊断
8226; 判定癌的可能起源
8226; 癌症的预后因子
8226; 证实感染
8226; 宫内孕的诊断
8226; 其它 ……
肿瘤的鉴别诊断
8226; 梭形细胞肿瘤(梭形细胞癌、肉瘤)
8226; 小圆细胞肿瘤的鉴别(淋巴瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、小细胞癌)
8226; 透明细胞肿瘤(肾细胞癌、粘液表皮样癌、肌上皮癌、恶性黑色素瘤、印戒细胞癌)
8226; 其他
常用的抗体
8226; Pan-cytokeratin——上皮性肿瘤
§ LCA ——淋巴瘤
§ S100 、Melin-A——恶性黑色素瘤
§ Vimentin---------肉瘤
§ NSE、CGA------神经内分泌肿瘤
§ Muscle、Myogenin-----肌源性肿瘤
角蛋白染色注意事项
角蛋白也可表达于非上皮性肿瘤中,这种表达常不规则:
§ 血管肿瘤,尤其是上皮样血管瘤和血
管肉瘤。
§ 淋巴结中单个指突状细胞(不要误为
转移癌)。
§ 平滑肌或骨骼肌肿瘤
§ 肌纤维母细胞
§ 其它肿瘤
LCA染色注意事项
8226; 并非所有的淋巴造血系统肿瘤均表达LCA
8226; 浆细胞瘤常LCA 阴性
8226; 一些类型淋巴瘤常为阴性
§ 大细胞间变淋巴瘤
§ 淋巴母细胞淋巴瘤
8226; 如果LCA阴性仍不除外淋巴瘤,补染其它标记物
肿瘤诊断
8226; 可以对破碎或微小癌甚至不易察觉的病变(胃活检中印戒细胞癌 )进行诊断
§ 没有免疫组化,诊断或许难以进行。
§ 角蛋白染色可以清晰地显示癌细胞。
§ 寻找异常的染色区域:如不规则的岛状
、条索状结构或正常粘膜中散在单个细胞。
良性还是恶性?
§ B细胞/浆细胞增生性病变,如果出现轻
链限制性则支持恶性肿瘤。
§ 出现异常免疫表型,如B细胞同时表达
CD43,CD5或 cyclinD1则支持B细胞淋
巴瘤的诊断。
§ 除个别例外,任何淋巴组织增生出现
ALK1表达,均提示大细胞淋巴瘤。
8226; 良性还是恶性?
增生标记物——Ki67
§ 如果在脑膜瘤、胃肠道间质肿瘤或甲
状旁腺肿瘤中Ki67 指数很高,提示为
恶性。
§ Ki67染色可以帮助鉴别萎缩上皮(少
数细胞阳性)和CINIII(多数细胞阳性)
8226; 原位病变/良性病变还是恶性
Actin可以清晰地显示乳腺的肌上皮细胞
§ 乳头状瘤与导管内乳头状癌
§ 硬化性腺病与管状腺癌
§ 导管内癌是否有浸润性成分?
§ 导管内癌导致的硬化性腺病还是真正的
浸润性癌?
8226; 原位病变/良性病变还是恶性
用34BE12(高分子量角蛋白)标记前列腺基底细胞
§ PIN还是浸润性癌?
§ 局灶性不典型腺体或密集腺泡(如腺病或
硬化性腺病):良性还是前列腺癌
8226; 是否为肝细胞癌?
§ 肝细胞癌还是腺癌(原发/转
移)?
§ CEA呈小管状阳性被用做肝细胞癌 的诊断依据。
是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤(如颗粒细胞瘤或支持细胞瘤)?
目前有以下几种性索细胞标记物:
Inhibin
CD99
MART-1(黑色素瘤相关标记物)
8226; 是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤(如颗粒细胞瘤或支持细胞瘤)?
目前有以下几种性索细胞标记物:
Inhibin
CD99
MART-1(黑色素瘤相关标记物)
8226; 浆膜腔活检或积液诊断中的难题:
§ 反应性间皮细胞还是腺癌?
§ 腺癌还是间皮瘤?
§ 最好的间皮细胞标记物:Calretinin
§ 鉴别诊断中最好的腺癌标记物:BerEP4,
CEA
8226; 神经内分泌肿瘤的分类
§ 诊断神经内分泌肿瘤必须有明确的全神
经内分泌标记物阳性:Syn和或CgA。
§ 区分类癌与副神经节瘤:前cytokeratin +
,后者可见支持诊断的S100+细胞。
8226; 淋巴瘤分类
§ 确定瘤细胞谱系:L26 (B细胞),CD3
(T细胞),CD56(NK 细胞)
§ 淋巴母细胞瘤:TdT
§ 套细胞淋巴瘤:Cyclin D1
§ 滤泡性淋巴瘤:CD10 或 bcl-6
§ 间变性大细胞淋巴瘤: CD30,ALK1
§ Burkitt 淋巴瘤:Ki67 (几乎100%细胞阳
性)
胸腺瘤分类
§ 胸腺瘤还是淋巴瘤:Cytokeratin 和 LCA
最有用
§ 胸腺瘤还是胸腺癌
1)TdT+淋巴细胞 支持胸腺瘤的诊断。
2)如果上皮细胞CD5+,支持胸腺癌的诊断。
§ 是否是胸腺瘤:有TdT+性淋巴细胞存在或
上皮细胞表达CD20,提示为胸腺瘤
8226; 胃肠道间质肿瘤分类
§ 胃肠道间质肿瘤:最常见的表型:c-kit+, actin-,desmin-
§ 平滑肌肿瘤:c-kit-,actin+,desmin+
§ 雪旺氏瘤:c-kit-,actin-,desmin-,
S100+
8226; 软组织肿瘤分类(标记物非常有限)
§ 纤维组织细胞瘤没有可靠的标记物
§ S100:神经鞘瘤
§ EMA:滑膜肉瘤
§ Actin,desmin:肌源性肿瘤
§ Cytokeratin:滑膜肉瘤,上皮样肉瘤,横
纹肌样瘤
8226; 软组织肿瘤分类
§ CD31:血管肿瘤
§ CD34:血管肿瘤,孤立性纤维瘤,
DFSP, 血管周细胞瘤,梭形细胞脂肪瘤
§ Syn: PNET
§ CD99:尤文氏肉瘤/PNET
8226; 分期
淋巴结或骨髓中检测出微小转移灶,
提示预后不良:
判定癌瘤原发部位的
免疫组化标记物
8226; 器官特异性标记物:
§ 甲状腺球蛋白:甲状腺
§ 降钙素:甲状腺
§ PSA或PAP:前列腺
§ 表面活性物质:肺
§ BRST-2/GCDFP-15:乳腺
§ HEP-PAR1:肝
判定腺癌原发部位的
免疫组化标记物
8226; CK7:除胃肠道外,大多数腺癌均为阳性表达
8226; CK20:仅胃肠道 和女性生殖道腺癌、粘液腺癌为阳性表达。
8226; PE-10(表面活性物质):50%肺腺癌阳性
8226; TTF-1(甲状腺转录因子-1):80%以上肺腺癌阳性
8226; CA125:阳性表达提示女性生殖道起源 (偶尔肺、乳腺、胰管胆管 癌可呈阳性表达)
8226; BREAT-2(GCDFP-15):50%乳腺癌阳性
8226; 甲状腺球蛋白:甲状腺起源
8226; PSA:前列腺起源
判定鳞癌原发部位的免疫组化标记物
8226; 由于不同部位的鳞癌不表达不同表型,因此没有太多可用的标记物.
8226; CD5:阳性表明胸腺起源
8226; CD20:阳性提示膀胱移行细胞癌
8226; 原位杂交检测EB病毒:阳性提示鼻咽癌或EB 相关癌
判定小细胞癌原发部位的
免疫组化标记物
有几种可用的标记物:
§ CK20:Merkel细胞癌为阳性(原发涎腺肿
瘤也可阳性)
§ TTF-1:原发肺小细胞癌阳性
癌预后因子
8226; 激素受体:乳腺癌
8226; 增殖标记物(Ki67)是某些肿瘤的预后因子
8226; 癌基因与抑癌基因产物:c-erbB2, Rb,p16, p27, p21, ALK1.
ER/PR 判断标准:
≥5%/ 预后好(Favorable)
1-4% 交界性 (Borderline)
阴性/预后差(Negative/Unfavorable
确定感染
8226; 免疫组化可判定某些感染的实质 (有时病毒包含体难以发现)
Herpes
CMV
HPV
HBsAg
Pneumocystis
宫内孕的诊断
8226; 宫腔刮出物中证实有胎儿成分可有效的排除输卵管妊娠。
8226; 如果不见绒毛,角蛋白染色可显示蜕膜细胞中的滋养叶细胞,从而证实为宫内孕
免疫组织化学染色的基本过程
8226; 标本的准备
8226; 标本的固定
8226; 组织脱水、浸蜡及包埋
8226; 切片
8226; 免疫组化染色
组织标本的取材和保存
8226; 取材时需用锋利器械,避免挤压
8226; 避开出血坏死区域
8226; 病灶、交界、正常部位
8226; 大小约为 1x1x0.2cm
8226; 及时固定
8226; 印片法
将新鲜标本沿中心剖开,用载玻片轻压,细胞即黏附于玻片之上。
8226; 涂片法
常用于淋巴结、软组织、肝、肾、肺等的细针穿刺,如组织较少,将组织推在玻片上,然后用另一玻片轻压涂片。
8226; 沉淀法
主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等细胞较少的标本。将上述标本的瓶底自然沉淀液约5毫升离心,之后去掉上清,再涂片。
制备细胞玻片需注意
8226; 在印片或涂片前应涂胶,防止细胞脱落。
8226; 为节省试剂和便于观察,细胞应集中在直径0.6--1.0cm范围内。
组织和细胞标本的固定
8226; 使细胞内蛋白质凝固,减少细胞内分解酶的反应,防止细胞自溶。
8226; 保存组织和细胞内的抗原性,使抗原不失活、不弥散。
抗原分类
8226; 不稳定性抗原:T淋巴细胞表面抗原等。
8226; 半稳定性抗原:如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等。
8226; 稳定性抗原:HBSAg AFP CEA Keratin 、 S-100等。
常用固定液
8226; 甲醛固定液
10%福尔马林
10%中性福尔马林(含碳酸钙)
10%中性缓冲福尔马林(PBS)
其中以最后一种在免疫组化中最常用。
8226; 4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液
较适用于免疫细胞化学染色。
注意事项
8226; 组织块大小 2*2*0.5cm
8226; 组织应及时固定
8226; 组织固定后必须彻底冲洗,除去残留固定液,一般用PBS缓冲液冲洗
影响固定的因素
8226; 温度:一般固定剂随温度升高固定能力增强,以室温最常用,某些酶需37度下固定,某些病毒需低温下固定。
8226; 浓度:10%中性甲醛,4%多聚甲醛最合适,乙醇最常用95%
8226; 固定时间:视组织块大小,固定液种类、浓度、温度而定。
常用的标记酶
8226; 辣根过氧化物酶
8226; 碱性磷酸酶
免疫组织化学方法
8226; 60年代发展起来的新方法,把抗原抗体免疫反应和酶催化作用结合起来,即吸收了免疫荧光、放射免疫的优点,又克服了它们的缺点。(1)不需要特殊的显微镜观察(2)定位准确,对比度好,染色标本可长期保存(3)可用苏木素等衬染,与形态结构结合观察(4)反应产物易分辨。
8226; 直接法:将酶结合在抗体上形成酶标记抗体,然后和抗原反应,再与酶的底物反应显色,在抗原抗体反应部位形成棕色或深棕色产物。
8226; 间接法:将酶标记在第二抗体分子上,一般免疫组化多采用此法。敏感性强
PAP法-过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法
8226; 抗原和第一抗体结合后,再滴加第二抗体和PAP复合物,最终形成抗原-一抗-二抗-PAP复合物。
8226; 一抗和PAP复合物中抗HRP抗体必须来自同一动物属。
8226; PAP敏感性较高,较间接酶标法高20倍。背景染色也比较低。
亲和免疫组织化学技术
8226; 利用两种物质之间的高度亲和能力而相互结合的化学反应。亲和物不但相互之间有高度亲和力,与一些标记物如荧光素、酶、同位素、胶体金及铁蛋白等也有很强亲和力,从而可用荧光显微镜,酶加底物显色反应、放射自显影或电子显微镜观察。
8226; 常用的亲和物质包括:生物素、卵白素、植物凝集素、葡萄球菌A蛋白、IgG等。
ABC法
8226; 生物素与酶结合,形成生物素化HRP,再与卵白素按一定比例混合,形成复合物ABC
8226; 该复合物再与生物素化抗体结合。
8226; 具体步骤:特异性一抗与组织中抗原结合形成抗原抗体复合物,生物素化二抗再与一抗反应,最后ABC和生物素二抗结合,形成抗原-抗体-生物素化二抗-ABC
免疫组化相关技术
8226; 抗原修复
8226; 酶消化法:如胰酶、蛋白酶
8226; 对部分抗体而非全部抗体有效。
8226; 对一些抗体十分必要:如BerEP4,CD21,CD35。
8226; 如果固定时间过长,可能无效。
8226; 没有固定的消化时间,需要根据相应组织确定(固定时间越短,消化时间越短)。
8226;
8226; 加热法:
水浴,微波,加压煮沸,高压锅,蒸气浴
8226; 声处理
8226; 综合使用上述方法
8226;
8226; 检测系统
8226; 显色原的选择
8226; 抗体的选择
8226; 对照的使用
8226; 标准化与自动化
加热法优于酶消化法之处
8226; 染色结果更为恒定与一致;可以找到几乎适用于所有组织的处理时间。
8226; 一抗稀释倍数可以更高(省钱)
8226; 某些抗体只适用于加热法
适用于加热法的部分抗体
如果不加热修复则无
效的抗体
8226; ER
8226; PR
8226; Bcl-2
8226; TdT
8226; Ki-67
8226; cytokeratin
8226; BerH2/CD30
8226; LCA/CD45
8226; L26/CD20
8226; Chromogranin
8226; Myeloperoxidase
8226; CEA
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加热法抗原修复的注意事项
8226; 避免切片干涸(抗原可能完全丢失)。
8226; 加热后必须经过冷却(15-30’)(使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型)。
加压煮沸法
8226; 在非密封的压力锅中煮沸3升缓冲液
8226; 把切片架放入煮沸的液体中
8226; 密封压力锅使达到最大压力
8226; 达到最大压力后开始计算加热时间(推荐时间为2.5分钟;陈旧或固定时间长的标本为3分钟)
8226; 较微波法更有效
§ 可以同时处理更多的切片
§ 可达到更高的温度,因此更有效 (以更高倍数稀释抗体)
§ 加热均匀(避免了微波冷热不均
的现象)且节省时间
8226; 可能的缺陷:
质量差的加热锅有可能发生“爆炸”(塑料锅可能用于微波法中更安全?)
抗原修复法中的关键问题
8226; 充分的抗原修复是影响染色结果最重要的因素:比检测系统本身的敏感性更重要
8226; 要十分注意以下几个方面:
§ 加热温度
§ 加热时间
否则加热法可能对一些要求较高的抗体无效(如Ki67,PR)
抗原修复法中潜在的问题
8226; 固定时间较短的组织用较强的修复方法(如加压煮沸法或长时间酶消化)可导致组织形态破坏或组织完全消化
8226; 解决方法:多次实验选择更短的加热或酶消化时间
内源性生物素:加热法中的难题
8226; 加热法可以使内源性生物素或生物素样物质活性加强,在卵白素-生物素检测系统中产生假阳性结果。
8226; 不要把内源性生物素导致的假阳性误为阳性结果。
8226; 假阳性常为暗褐色,绒毛状或颗粒状(可以色很深),但没有真正的膜阳性。
8226; 容易受其影响的组织:
§ 肝脏
§ 线粒体丰富的组织,如肾,Hurthle 细胞
§ 胞浆丰富的瘤细胞
8226; 解决方法:卵白素 -生物素阻断;使用其它检测系统,如PAP, APAAP,EnVision等。
8226; 多种修复液可供选择:pH6.0的枸橼酸缓冲液(最常用),尿素,Tris-Hcl等。
8226; 最近研究表明碱性修复液更有效。
8226; 推荐:Ph8.0,1mM的EDTA缓冲液。可用于大多数适用于加热法的抗体。
8226; 传统的阳性对照
§ 在每组中设置已 知为阳性的对照。 § 确保所有试剂均 有效,操作步骤正 确。 |
8226; 传统的阴性对照 § 每例其中的一张切 片由正常血清代替。
§ 目的在于判定非特
异性染色的有无。 |
免疫组化在诊断中的应用
8226; 肿瘤鉴别诊断
8226; 判定癌的可能起源
8226; 癌症的预后因子
8226; 证实感染
8226; 宫内孕的诊断
8226; 其它 ……
肿瘤的鉴别诊断
8226; 梭形细胞肿瘤(梭形细胞癌、肉瘤)
8226; 小圆细胞肿瘤的鉴别(淋巴瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、小细胞癌)
8226; 透明细胞肿瘤(肾细胞癌、粘液表皮样癌、肌上皮癌、恶性黑色素瘤、印戒细胞癌)
8226; 其他
常用的抗体
8226; Pan-cytokeratin——上皮性肿瘤
§ LCA ——淋巴瘤
§ S100 、Melin-A——恶性黑色素瘤
§ Vimentin---------肉瘤
§ NSE、CGA------神经内分泌肿瘤
§ Muscle、Myogenin-----肌源性肿瘤
角蛋白染色注意事项
角蛋白也可表达于非上皮性肿瘤中,这种表达常不规则:
§ 血管肿瘤,尤其是上皮样血管瘤和血
管肉瘤。
§ 淋巴结中单个指突状细胞(不要误为
转移癌)。
§ 平滑肌或骨骼肌肿瘤
§ 肌纤维母细胞
§ 其它肿瘤
LCA染色注意事项
8226; 并非所有的淋巴造血系统肿瘤均表达LCA
8226; 浆细胞瘤常LCA 阴性
8226; 一些类型淋巴瘤常为阴性
§ 大细胞间变淋巴瘤
§ 淋巴母细胞淋巴瘤
8226; 如果LCA阴性仍不除外淋巴瘤,补染其它标记物
肿瘤诊断
8226; 可以对破碎或微小癌甚至不易察觉的病变(胃活检中印戒细胞癌 )进行诊断
§ 没有免疫组化,诊断或许难以进行。
§ 角蛋白染色可以清晰地显示癌细胞。
§ 寻找异常的染色区域:如不规则的岛状
、条索状结构或正常粘膜中散在单个细胞。
良性还是恶性?
§ B细胞/浆细胞增生性病变,如果出现轻
链限制性则支持恶性肿瘤。
§ 出现异常免疫表型,如B细胞同时表达
CD43,CD5或 cyclinD1则支持B细胞淋
巴瘤的诊断。
§ 除个别例外,任何淋巴组织增生出现
ALK1表达,均提示大细胞淋巴瘤。
8226; 良性还是恶性?
增生标记物——Ki67
§ 如果在脑膜瘤、胃肠道间质肿瘤或甲
状旁腺肿瘤中Ki67 指数很高,提示为
恶性。
§ Ki67染色可以帮助鉴别萎缩上皮(少
数细胞阳性)和CINIII(多数细胞阳性)
8226; 原位病变/良性病变还是恶性
Actin可以清晰地显示乳腺的肌上皮细胞
§ 乳头状瘤与导管内乳头状癌
§ 硬化性腺病与管状腺癌
§ 导管内癌是否有浸润性成分?
§ 导管内癌导致的硬化性腺病还是真正的
浸润性癌?
8226; 原位病变/良性病变还是恶性
用34BE12(高分子量角蛋白)标记前列腺基底细胞
§ PIN还是浸润性癌?
§ 局灶性不典型腺体或密集腺泡(如腺病或
硬化性腺病):良性还是前列腺癌
8226; 是否为肝细胞癌?
§ 肝细胞癌还是腺癌(原发/转
移)?
§ CEA呈小管状阳性被用做肝细胞癌 的诊断依据。
是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤(如颗粒细胞瘤或支持细胞瘤)?
目前有以下几种性索细胞标记物:
Inhibin
CD99
MART-1(黑色素瘤相关标记物)
8226; 是否为卵巢或睾丸的性索肿瘤(如颗粒细胞瘤或支持细胞瘤)?
目前有以下几种性索细胞标记物:
Inhibin
CD99
MART-1(黑色素瘤相关标记物)
8226; 浆膜腔活检或积液诊断中的难题:
§ 反应性间皮细胞还是腺癌?
§ 腺癌还是间皮瘤?
§ 最好的间皮细胞标记物:Calretinin
§ 鉴别诊断中最好的腺癌标记物:BerEP4,
CEA
8226; 神经内分泌肿瘤的分类
§ 诊断神经内分泌肿瘤必须有明确的全神
经内分泌标记物阳性:Syn和或CgA。
§ 区分类癌与副神经节瘤:前cytokeratin +
,后者可见支持诊断的S100+细胞。
8226; 淋巴瘤分类
§ 确定瘤细胞谱系:L26 (B细胞),CD3
(T细胞),CD56(NK 细胞)
§ 淋巴母细胞瘤:TdT
§ 套细胞淋巴瘤:Cyclin D1
§ 滤泡性淋巴瘤:CD10 或 bcl-6
§ 间变性大细胞淋巴瘤: CD30,ALK1
§ Burkitt 淋巴瘤:Ki67 (几乎100%细胞阳
性)
胸腺瘤分类
§ 胸腺瘤还是淋巴瘤:Cytokeratin 和 LCA
最有用
§ 胸腺瘤还是胸腺癌
1)TdT+淋巴细胞 支持胸腺瘤的诊断。
2)如果上皮细胞CD5+,支持胸腺癌的诊断。
§ 是否是胸腺瘤:有TdT+性淋巴细胞存在或
上皮细胞表达CD20,提示为胸腺瘤
8226; 胃肠道间质肿瘤分类
§ 胃肠道间质肿瘤:最常见的表型:c-kit+, actin-,desmin-
§ 平滑肌肿瘤:c-kit-,actin+,desmin+
§ 雪旺氏瘤:c-kit-,actin-,desmin-,
S100+
8226; 软组织肿瘤分类(标记物非常有限)
§ 纤维组织细胞瘤没有可靠的标记物
§ S100:神经鞘瘤
§ EMA:滑膜肉瘤
§ Actin,desmin:肌源性肿瘤
§ Cytokeratin:滑膜肉瘤,上皮样肉瘤,横
纹肌样瘤
8226; 软组织肿瘤分类
§ CD31:血管肿瘤
§ CD34:血管肿瘤,孤立性纤维瘤,
DFSP, 血管周细胞瘤,梭形细胞脂肪瘤
§ Syn: PNET
§ CD99:尤文氏肉瘤/PNET
8226; 分期
淋巴结或骨髓中检测出微小转移灶,
提示预后不良:
判定癌瘤原发部位的
免疫组化标记物
8226; 器官特异性标记物:
§ 甲状腺球蛋白:甲状腺
§ 降钙素:甲状腺
§ PSA或PAP:前列腺
§ 表面活性物质:肺
§ BRST-2/GCDFP-15:乳腺
§ HEP-PAR1:肝
判定腺癌原发部位的
免疫组化标记物
8226; CK7:除胃肠道外,大多数腺癌均为阳性表达
8226; CK20:仅胃肠道 和女性生殖道腺癌、粘液腺癌为阳性表达。
8226; PE-10(表面活性物质):50%肺腺癌阳性
8226; TTF-1(甲状腺转录因子-1):80%以上肺腺癌阳性
8226; CA125:阳性表达提示女性生殖道起源 (偶尔肺、乳腺、胰管胆管 癌可呈阳性表达)
8226; BREAT-2(GCDFP-15):50%乳腺癌阳性
8226; 甲状腺球蛋白:甲状腺起源
8226; PSA:前列腺起源
判定鳞癌原发部位的免疫组化标记物
8226; 由于不同部位的鳞癌不表达不同表型,因此没有太多可用的标记物.
8226; CD5:阳性表明胸腺起源
8226; CD20:阳性提示膀胱移行细胞癌
8226; 原位杂交检测EB病毒:阳性提示鼻咽癌或EB 相关癌
判定小细胞癌原发部位的
免疫组化标记物
有几种可用的标记物:
§ CK20:Merkel细胞癌为阳性(原发涎腺肿
瘤也可阳性)
§ TTF-1:原发肺小细胞癌阳性
癌预后因子
8226; 激素受体:乳腺癌
8226; 增殖标记物(Ki67)是某些肿瘤的预后因子
8226; 癌基因与抑癌基因产物:c-erbB2, Rb,p16, p27, p21, ALK1.
ER/PR 判断标准:
≥5%/ 预后好(Favorable)
1-4% 交界性 (Borderline)
阴性/预后差(Negative/Unfavorable
确定感染
8226; 免疫组化可判定某些感染的实质 (有时病毒包含体难以发现)
Herpes
CMV
HPV
HBsAg
Pneumocystis
宫内孕的诊断
8226; 宫腔刮出物中证实有胎儿成分可有效的排除输卵管妊娠。
8226; 如果不见绒毛,角蛋白染色可显示蜕膜细胞中的滋养叶细胞,从而证实为宫内孕