分子诊断的不同靶向和选择

分子诊断针对多肽、蛋白质，所应用的技术有蛋白质组学、组织阵列（tissue array）、免疫组织化学和流式细胞检查⁽¹⁵⁾；针对核酸DNA和RNA，有原位杂交(in situ hybridization,ISH)、酶促体外核酸扩增即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、即时PCR（real-time PCR）、逆转录酶聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)、DNA测序(sequencing)、指纹印记（fingerprint）和DNA微阵列（microarray）。传统的病理组织检查，是组织切片苏木素-伊红染色，显微镜下读片。基于分子生物学理论和技术的引进，病理学观察视野极大扩展开（图1）。在传统组织切片上，可进行免疫组织化学和核酸原位杂交。这两项技术应用的最大共同优势，在于可识别所检物质的细胞定位和显示组织中细胞的异质性。为了靶向物质的精确定位，可采用微切割技术取下单个细胞或细胞团，进行专项研究。把组织块切出5-10片，置入小离心管中，做成匀浆并针对不同靶向物质，提取蛋白质、RNA或DNA，再进行蛋白质印迹、RNA印迹或DNA印迹检测。印迹检测所用细胞量较大，在进行细胞内特定物质检测时，特别是针对肿瘤，由于混有一定数量的正常细胞，在分析结果时应注意混有正常细胞的复杂性。匀浆中提取的DNA达不到检测用量，先进行PCR扩增是恰当的选择。因此PCR除了本身可以用于特定靶序列的检测，还有为其他技术应用做好前期扩增准备工作如DNA测序、微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI）等。细胞中mRNA经提取后，可用逆转录酶转录成cDNA，同样进入DNA操作流程，它所揭示和研究的靶向是mRNA表达水平。现在比较关注的新技术基因芯片或DNA微阵列，一张芯片可涵盖成千上万的DNA序列片段，它们的应用优势在于大通量，并可进行基因群的变化比较。DNA微阵列有待提高的是检测特异性和敏感性。一种疾病或基因异常，可以通过基因编码序列、转录表达水平、蛋白质表达产物，不同角度来揭示改变。以最具诊断价值的基因易位或融合基因为例，在染色体和间期核水平上，可选择应用传统的核型分析（Karyotyping）或原位杂交技术；把病理组织做成匀浆，可应用DNA印迹反应，显示变异条带；如果有可用的抗体，免疫组织化学可揭示融合基因蛋白的表达，最简单可行的方法当属RT-PCR，只要设计好一对合适的引物，就可以在RNA逆转录成cDNA基础上，扩增出所检测的靶序列并加以认证。白血病、淋巴瘤、1/3以上的软组织肿瘤可存在不同类型的基因易位或融合基因，可有各自检测的最佳方法选择（图2）。当代病理学家，从病患需求出发，不仅应该熟知病理组织学变化的判读，还应该学习和掌握针对不同疾病所应采用的最适当分子诊断技术，并熟知分子技术所揭示的组织改变的判读，给予临床和病人以最详尽的诊断报告。分子生物技术用于疾病检测有助于快速诊断，缩短了操作时间；有助于早期诊断，如产前诊断、症前诊断；及时而准确地揭示相关病因，特别是感染因子。协助推断疾病的预后和预测因素，在疾病的进展和治疗过程中，监控疾病过程和治疗反应。核酸水平上的诊断与免疫组织化学相辅相成，形成当代认识疾病、诊断疾病的新阶段