用免疫组化ABC 法的漂片法做好脑片实验的体会                                                         

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                                                巴迎春    ,王廷华   ,李明                               

                   (1.昆明医学院解剖教研室　昆明　650031;2.昆明医学院神经研究所　昆明　650031)          

　　ABC 法是将亲和素作为桥,把生物素化的抗体与生物素             212　013 % H2O2避光反应30min:是为了去除脑组织切片

结合的酶连接起来。首先,以I抗与组织切片共孵育,使特异             中过氧化物酶,H2O2 的浓度不能过高,时间不能太长,否则容

性I抗与组织中的相应抗原结合,之后加上生物素标记的II              易烂片。                                

抗,II抗与I抗通过抗原2抗体反应结合,最后加入ABC 复合              213　0101M PBS漂洗5min,3次:以洗净片子上的 H2O2。

物,II抗上的生物素则与ABC 复合物中的亲和素上空下的位             214用1% TritonX2100(三硝基甲苯)漂洗脑片30 min:TritonX2

点结合。用ABC 法中的漂片法做脊髓冰冻切片的染色比较              100为一种表面活性剂,可以增加抗体对细胞膜的穿透力。
容易做出结果,但如果是用此法做大鼠脑的冰冻切片染色则                                                     
                                                                215用5 %羊血清封闭30min:目的是使片子上的非特异性
较难做出结果,特别是做出漂亮的脑片更难。作者在用ABC                                                      
                                                                反应物和羊血清结合,以降低片子的染色背景,增强对比度。
漂片法做脑组织冰冻切片的免疫组织化学实验的过程中,通                                                     
                                                                216加I抗(用终浓度为2%的羊血清稀释),反应24h248h:应放
过改变常规的操作步骤环节,使做出的脑片质量大为提高。                                                     
                                                                在4℃冰箱缓慢反应,如时间过短和孵育温度过高则可能产生大
以下实验技术介绍的是将免疫组化ABC 法的漂片法用于脑                                                      
                                                                量非特异性反应物,致使染色背景加深而影响脑片的对比度。同
组织冰冻切片中的几点体会。                                                                              
                                                                时在I抗中还应加入TritonX2100,使其终浓度达到011% 。
1脑片的取材、切片                                                                                       
                                                                217　0101M PBS漂洗5min,3次:以洗去脑片上未反应的 I
    将Wistar大鼠以315% 戊巴比妥钠麻醉,019% 盐水从左                                                     
                                                                抗。                                    
心室灌洗后,灌注加有饱和苦味酸的4% 多聚甲醛(因苦味酸                                                     
                                                                218加入用2 %羊血清稀释成的 II抗:37℃温箱中反应2h,
穿透迅速,与多聚甲醛混合后作固定液,可在不影响抗原性的                                                    
                                                                加羊血清是为了进一步降低脑片染色背景。  
前提下沉淀蛋白质,改善对膜与胞质的固定作用,并能增加片                                                    
                                                                219　0101M PBS漂洗5min,3次:以洗去脑片上未反应的Ⅱ抗。
子的韧性使其不容易碎裂),取脑分割作几块,置于20% 蔗糖                                                     
                                                                2110加入AB复合物(1:100):37℃温箱中反应2h,配制AB
溶液中静置48h 沉底(目的是为了将脑组织块中的水份充分                                                     
                                                                复合物的比例为A:B:0101MPBS=1:l:100。    
脱去,但不一定以是否沉底作为组织块脱水的标志。有时在                                                     
                                                                2111　0101M PBs漂洗5 min,3次:以洗去脑片上未反应的
蔗糖液中即使放几天或更长时间脑组织块也不见沉底,此时                                                     
很可能组织块中的水份早已脱去但不一定沉底,故不需等到             AB复合物。                              

沉底即可进行下一步操作,置于20% 蔗糖中的时间一般不要             2112　DAB显色5min:时间不必要太长,一般不超过10min,

超过一周),做脑组织切片前最好将组织块首先放入液氮中冰            因为阳性物质超过一定时间是不可能随时间延长而继续增加

冻,以免切片时脑片中产生冰晶(如脑片中出现冰晶则会影响            的。但时间也不能太短,否则有的阳性反应物因为时间不够

染色效果和片子质量),这是因为大脑皮质富含水份,通过液             可能不会出现。显色结束后用0101MPBS 滴于片子上终止

氮处理则能使组织块跨过冰晶期,从而避免了冰晶形成。接             反应。DAB 显色液的配制为:将DAB5mg 溶于0105mol/L
着于冰冻切片机上进行冠状切片(片厚20μm),切好的脑片用            Tris H Cl10ml中,在显色前再加入30% H20210μl。

0101M PBS反复漂洗以将苦味酸的黄色洗去,于4℃冰箱保               2113　漂片、裱片、晾干:可用蒸馏水来漂片和裱片,但不能用

存,脑片免疫组织化学实验的具体操作步骤如下。                     PBS因其含盐会导致晾片后出现结晶。裱片用毛笔,然后隔

2脑片的免疫组织化学实验                                         夜晾干或用风扇吹干。                    

211　将脑片用0101M PBS漂洗5 min,3次。                           2114梯度酒精脱水,二甲苯通透:脱水酒精的浓度从75%