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redsnow007 离线
我们医院开展有两年多了,FISH技术比较成熟,以下是乳腺石蜡切片样本FISH实验流程
一、玻片预处理
1、65℃烤片过夜。
2、室温 二甲苯15分钟 X 3次。
3、室温 100%酒精5分钟X 2次。
4、室温 85%酒精、70%酒精各3分钟。
5、室温 去离子水3分钟,用无绒纸巾吸取多余水分。
6、90℃,去离子水煮沸25分钟或免疫组化修复液(PH7.0)煮沸20分钟。
7、待片子室温晾干后,37℃蛋白酶K消化12-15分钟(取0.4ml蛋白酶K储存
液(20mg/ml)溶于40ml 2xSSC(PH7.0),得到蛋白酶K工作液(200μg/ml)。如果是免疫组化修复液,蛋白酶K修复10分钟。
8、室温,2xSSC 5分钟2次
9、室温,70%、85%、100%乙醇脱水各3分钟。
10、自然干燥玻片。
二、变性杂交
杂交仪变性杂交流程
1.56℃,烤片2-5分钟
2、探针准备:①交液8μl
②探针2μl
加入到0.5ml离心管中混匀,离心1-3秒,混匀备用。
3、将10μl探针混合物加于玻片杂交区域,立即加盖盖玻片,用橡皮胶封边。
4、准备杂交仪,共变性条件:83℃ 5分钟,杂交条件:42℃16小时。
三、玻片洗涤与观察
1、46℃,2xSSC 10分钟
2、46℃,0.1%NP-40/2xSSC 5分钟
3、室温,70%乙醇3分钟
4、暗处自然干燥玻片。
5、室温,将15μl DAPI复染剂滴加于杂交区域,立即盖上盖玻片,15分钟后观察。
四、判断标准
分别数30个癌细胞的红绿信号数,设红信号与绿信号的比值为K
①当K〈1.8时 判为阴性
②当1.8〈K〈2.2时 为临界值
③当K〉2.2时 判为阳性
当K为临界值时,要重新数100个癌细胞的红绿信号数,再计算比值。计算仍为临界值的,则要重做或另取材。
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