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wangzhen_01 离线
以下是引用wangzhen_01 在2007-5-2 23:36:00的发言: Her-2免疫组织化学和原位杂交图片 |
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原位杂交组织化学概述
一、核酸分子杂交技术
1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究,其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价键的形成,出现稳定的双链区,形成杂交的双链。自此以后,由于分子生物学技术的迅猛发展,特别是70年代末到80年代初,分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功,核酸自动合成仪的诞生,大大丰富了核酸探针的来源,新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种:液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中,而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜,其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等),另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交( colony in situ hybridization)、斑点杂交法(Dot blot)、Southern印迹杂交(Southern blot)、Northern印迹杂交( Northern blot)和组织原位杂交(Tissue in situ hybridization),即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。
二、原位杂交组织化学技术的由来及发展
原位杂交组织(或细胞)化学技术简称原位杂交(In situ hybridization),如上所述,属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA,然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段,而 Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交,确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时,Buongiorno– Nardelli和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位,从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交,首次用原位杂交检测了病毒 DNA在细胞中的定位,但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞,探针均采用同位素标记。
由于同位素标记探针具有放射性既污染环境,又对人体有害,且受半衰期限制等缺点,科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交,然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer(1982)报道用2,4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针,使该DNA探针具有抗原性,然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针,最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用,但因敏感度不够高,应用不够普遍。 Pezzella(1987)创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法,其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化,利用单克隆抗体识别磺基化探针,再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体,从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便,不需作缺口平移标记,敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后,已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat(1983)首先建立的,它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒 DNA,通过生物素与抗生物素结合,过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用,特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术,该技术是用光敏生物素(Photobiotin)标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素,它们都是由三个部分组成:光敏基团、连结臂和生物素(图20-1)。在强光下,不需酶反应,光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸,方法简单,灵敏度也不低,但标记效率不高,每 100~150个碱基才能标记一个生物素,对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用,以免因标记数过少而影响灵敏度(Forster et al 1985)。
近年来,地高辛(Digoxigonin)标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio-chemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样,地高辛较放射性标记系统安全,方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越,可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶 -抗碱性磷酸酶显色系统),有较好的反差背景。
核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。 DNA探针还有单链DNA(Single stranded, ssDNA)和双链DNA(Double stranded, dsDNA)之分(详见十九章)。早期应用的主要是DNA探针,继之Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了cDNA探针(complementary DNA),其基本原理是以RNA为模板,经逆转录酶(reverse transcriptase)又称为RNA指导的DNA聚合酶催化产生的。该酶以RNA为模板,按照RNA的核苷酸顺序合成DNA,这一途径与一般遗传信息流的方向相反,故称逆转录。CDNA是指互补于mRNA的DNA分子。RNA探针是将特异性的 cDNA片段插入含有相当的RNA聚合酶启动子的转录性载体。这类载体包括pSP64和pSP65,它们具有不同的启动子在多克隆位点的各侧。Psp64和pSP65在sP6启动子的多克隆位点的方向是不同的。通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶,可以控制RNA的转录方向,即以哪条DNA链为模反转录RNA。从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针(Sense probe)和与 mRNA互补的反义RNA探针(antisense probe),又称互补RNA探针(complementary RNA probe , cRNA)。通常用同义RNA探针做为反义RNA探针的阴性对照。由于RNA探针是单链分子,所以它与靶序列的杂交反应极高。有报告认为其杂交率高于DNA探针的8倍。 DNA合成仪的诞生使制造寡核苷酸探针成为可能,与上述探针不同的是寡核苷酸探针不是克隆性 DNA探针,它是由DNA合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便,价格低廉的优点,也可进行放射性与非放射性标记,但其特异性不如克隆性探针强,亦不如其杂交信号高。
原位杂交组织化学技术在近 20年的发展可以说是飞跃的,其突出的特点是由分子遗传学研究提供的探针大量增加,探针生产的可靠性和速率大大发展了,更重要的是非放射性标记物的发展使原位杂交组织化学技术在不久的将来将和现今的免疫细胞化学技术一样成为实验室的常规技术和临床日常应用的诊断技术。新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。 Coulton(1991)建议将非放射性标记技术更名为亲合复合物标记技术(Affinity– Complex Labelled Probes, ACLP )。因为“非( non)“在英文里是一个否定的名词,而且根据非放射性标记技术的原理是将一个标记物利用其亲合性,应用直接或间接的方法结合在核苷酸分子上。
原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。它使它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展。其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学。