第十次免疫组织化学质量控制存在的问题、原因分析和建议

单位编号：3

得分：CD3（5分）、CD21（5分）

问题：无信号

原因：你们的CD20和Ki-67染色非常好，说明所有试剂都是好的，方法也没有问题。但是你们用的抗体和检测系统是不同试剂公司的，虽然CD20和Ki-67没有问题，但是可能CD3和CD21一抗与检测系统不配。也可能是某一步骤遗漏，也可能是这两个抗体失效。

建议：（1）、照原来做法重复一遍，如果有阳性了，说明是某一步骤遗漏；（2）、用同一公司的检测系统试一次，如果结果理想，证明是抗体与检测系统不配；（3）、如果仍然不好，可能是抗体问题。

单位编号：5

得分：CD3（8分）

问题：很微弱信号

原因：可能与使用胰酶消化，及采用柠檬酸修复液以及很短的5分钟修复时间有关，或与使用SP法有关。

建议：采用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。微波炉修复时间，先高档修复3分钟后，低档维持15－20分钟。建议使用二步法进行检测。

单位编号：12

得分：CD21（10分）

问题：无信号

原因：可能与使用柠檬酸修复液和修复温度（98度）不够有关，或与使用SP法有关。

建议：尝试采用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。最好使用二步法进行检测。

单位编号：13

得分：CD21（10分）

问题：CD21染色较弱，阳性区域未全部显色。

原因：可能与采用柠檬酸修复液有关。

建议：使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。

单位编号：15

得分：CD21（12分）

问题：CD21染色较弱，阳性区域未全部显色。

原因：可能与采用柠檬酸修复液有关。检测系统只有10分钟，可能短了点。

建议：使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。检测系统孵育时间在冬日应该在15－20分钟。

单位编号：16

得分：CD21（12分）

问题：CD21染色较弱，阳性区域未全部显色。

原因：可能与采用柠檬酸修复液，及修复修复温度（98度）不够有关

建议：使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。修复温度上调到100度。

单位编号：26

得分：CD3（10分）

问题：一片黄

原因：方法有几个问题：（1）、一抗时间过短（30分钟）；（2）、胰酶消化后又加柠檬酸高压锅热修复；（3）、使用SP法，用血清是不能封闭内源性生物素的。

建议：一抗孵育时间1小时。采用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。并使用二步法。

单位编号：27

得分：CD21（5分）

问题：无信号

原因：可能是某一步骤遗漏，也可能是抗体失效。另外，一抗孵育时间过长（180分钟，28度），采用柠檬酸修复液有关，

建议：（1）、照原来做法重复一遍，如果有阳性了，说明是某一步骤遗漏；（2）、如果仍然不好，可能是抗体问题。另外，一抗孵育时间夏日大约40分钟，冬日1小时，180分钟时间过长。使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。

单位编号：29

得分：CD3（11分）、CD21（5分）、Ki67（5分）

问题：CD3一片黄，CD21无信号，Ki67无信号

原因：方法有问题，应该改进。

建议：

免疫组化实验操作程序（二步法）

1.        4μm厚的切片贴于APES玻片上，烤片                  1小时  60 °C.

2.   二甲苯                                                      3 x 10’

3.   99% 酒精                                                    3 x 3’

4.   96% 酒精                                                    2 x 3’

5.   75%酒精                                                     2 x 3’

6.   1.5%-3%H2O2                                                  10’

7.  TBS                                                            3’

8.  EGTA（pH9.0迈新），微波炉最高挡3’，换成最低挡15’微波修复，凉至室温

9.  TBS                                                            3’

10  第一抗体                                                       60’

11.  TBS                                                            3’

12．A液(迈新ELivision)                                             15’

13.  TBS                                                            3’

14.  B液(迈新ELivision)                                             20’

15.  TBS                                                            3’

16  DAB (1ml蒸馏水+1滴DAB+1滴TBS+1滴H2O2)                  2-10’

17. 自来水冲洗                                                       5’

18.  Mayers 苏木素                                                  1-3’

19. 自来水冲洗                                                       5’

单位编号：30

得分：Ki67（5分）

问题：无信号

原因：方法没有大问题。唯一可能的原因是柠檬酸修复，因为pH太低。核表达的抗原多数需要pH高的修复液。

建议：使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。

单位编号：34

得分：CD3（11分）、Ki67（5分）

问题：CD3背景较重、Ki67无信号

原因：主要是修复问题。修复好了，不需要120分钟的一抗孵育时间，柠檬酸修复能力低，修复时间才10分钟，不够！也不知你们修复温度是多少。至少应该应该煮开（100度）。

建议：采用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。如果用微波炉，先用高档3分钟烧开，再换成抵挡维持15－20分钟。这样修复后，一抗用1小时就够了。

单位编号：36

得分：CD21（8分）、Ki67（5分）

问题： CD21阳性区域未全部显色，Ki67无信号

原因：主要是修复问题。可能与采用柠檬酸修复液，时间也不够（仅15分钟）及SP法有关。

建议：采用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。如果用微波炉，先用高档3分钟烧开，再换成抵挡维持15－20分钟。并使用二步法检测系统。

单位编号：38

得分：CD21（12分）

问题：CD21阳性区域未全部显色

原因：可能与采用柠檬酸修复液和煮沸修复时间不够（才3分钟）有关。

建议：使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。如用微波炉加热修，先用高档3分钟烧开，再换成抵挡维持15－20分钟。

单位编号：42

得分：CD21（9分）

问题：CD21阳性区域未全部显色

原因：从提供的方法中看不出明显问题。

建议：自己再用淋巴结或扁桃体试试看看。

单位编号：46

得分：CD21（9分）

问题：CD21染色较弱，阳性区域未全部显色。

原因：可能与采用柠檬酸修复有关，虽然你们用同样方法染其他抗体效果很好，可能对CD21不太有效。

建议：采用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复，试试。

单位编号：47

得分：CD21（5分）

问题：几乎无信号

原因：可能与采用柠檬酸修复能力低有关。

建议：采用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。

单位编号：48

得分：CD21（9分）

问题：CD21染色较弱，阳性区域未全部显色。

原因：可能柠檬酸盐pH6.0与采用SP法检测系统有关。

建议：采用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。修复时间应该20分钟。采用二步法检测系统。

单位编号：50

得分：Ki67（11分）

问题：出现背景

原因：可能与一抗孵育时间太长（120分钟）、柠檬酸修复液有关。

建议：缩短一抗孵育时间，夏日40分钟，冬日1小时。使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。

单位编号：56

得分：CD3（10分）、CD20（9分）、CD21（8分）、Ki67（12分）

问题：每张切片都有很好的阳性信号，但是染色非常不均匀。苏木素染色太深。

原因：从方法上看不出大问题。出现染色不均匀的主要原因可能是切片部分干涸了，不能着色，没有完全干涸的区域着上了色。苏木素染色后没有分化。

建议：尽量不要让切片干涸。苏木素染色后用酸分化。

单位编号：58

得分：CD21（11分）

问题：CD21染色较弱，阳性区域未全部显色

原因：可能与采用柠檬酸修复液修复能力较弱有关，

建议：使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。

单位编号：71

得分：CD21（6分）

问题：几乎无信号

原因：可能与采用柠檬酸修复液有关，或与抗体有关。

建议：使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。看看是否有阳性信号，如果没有，可能是抗体有问题；如果有阳性信号，可能是修复液pH太低。

单位编号：73

得分：Ki67（6分）

问题：信号弱，部分区域无信号

原因：可能与采用柠檬酸修复液，修复能力低有关，

建议：采用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。

单位编号：74

得分：CD3（11分）、CD20（11分）、Ki67（12分）

问题：CD3和CD20一片黄，Ki67信号较弱。

原因：可能与采用柠檬酸修复液有关。

建议：使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。另外，建议测量一下冰箱是否真的是4度，如果温度太低，会影响抗原抗体反应，孵育过夜可能不行。

单位编号：77

得分：CD21（12分）

问题：信号弱

原因：可能与采用柠檬酸修复液有关，

建议：采用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。

单位编号：80

得分：CD21（12分）

问题：背景太深

原因：方法中看不出明显问题。可能与冲洗不够有关。

建议：两次3分钟洗涤。

单位编号：82

得分：CD21（5分）

问题：无信号

原因：可能与一抗孵育时间过短，或与柠檬酸修复液有关，

建议：一抗时间可控制在40分钟至一个小时之间。并使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。

单位编号：83

得分：CD3（12分） CD20（9分）、CD21（6分）、Ki67（11分）

问题：CD3脱片，信号弱；CD20信号弱且有背景；CD21一片黄； Ki67复染颜色较淡，信号弱。

原因：从提供的方法中看“一抗孵育时间：（60 ）分钟，温度（  4 ）℃”。要么温度要么时间不够。还可能与柠檬酸修复液有关，也可能是抗体滴度问题

建议：60分钟室温。并使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。

单位编号：85

得分：Ki67（7分）

问题：几乎无信号

原因：从提供的方法中看“修复温度：（100 ）℃， 时间（  5   ）分钟     保温10分钟 ”。修复时间不够。

建议：使用碱性修复液EDTA pH8.0或EGTA pH9.0进行修复。如用微波炉加热修，先用高档3分钟烧开，再换成抵挡维持15－20分钟。

 受益，谢谢

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